鱼类在经络研究中的运用和体会

中国中医科学院针灸研究所（0000）蒋瑾 张金铃 张璐 宋晓晶 罗明富

煤炭医院 （100028）晋志高2Δ

河南中医学 院（450008） 李继伟5

近年来，斑马鱼作为一种模式生物，已经越来越受到国内外医学界的重视。观赏鱼具有体积小、生殖周期短、体外受精且胚胎发育透明并且其基因与人类基因的相似度达到87%等特点。斑马鱼、锦鲤鱼等观赏鱼不仅外观漂亮，而且神经解剖研究者通过DiA 等荧光标记[1][2][3]观察到发亮的荧光标记物在神经系统的分布规律，为针灸经络机理的研究提供了形态学依据。本文就斑马鱼、锦鲤鱼、新月鱼作为一种在针灸经络研究中的应用做一探讨。

1 斑马鱼、锦鲤鱼、新月鱼简介

1.1 斑马鱼 生长于印度、巴基斯坦、孟加拉国等淡水河流中的一种硬骨鱼（鲤鱼）。成年鱼全长4～6cm。因全身横向分布着褐色斑马线而得名。对斑马鱼的研究始于20 多年前，最早从事研究的是美国Oregon大学的Streisinger[4]等。据估计，斑马鱼基因组中约有3万个基因，不仅数目与人类接近，而且它的许多基因与人类存在一一对应关系，因斑马鱼的胚胎透明，使其受到针灸经络和穴位研究者的重视。

1.2 锦鲤鱼 锦鲤[2]学名 Cry prinus carpiod，生物学上属于鲤科（Cy prinidae），世界各地均有野生鱼种，但以亚洲的中国和日本为多，是由食用鱼改良而来的观赏鱼品种。从比较胚胎学和进化论的观点看，人的胚胎发育早期的确有过类似鱼的过程，不仅外形像鱼一样有鳃裂和尾，而且心脏也像鱼一样只有两腔，因此，我们认为，用锦鲤作为实验对象进行穴位和经络研究，有充分的生物学依据。

1.3 新月鱼 成年红色新月鱼体表延纵轴方向分布着若干条褐色条纹，全长4～6cm。

DiA [4-（4-Diethylaminostyryl）-NMethylpyridinium Iodide]是一种荧光亲脂染料，它是体表感受器中毛细胞的特异性标记物，同时也可以标记神经纤维。应用DiA可以直接对处于正常生活状态下的鱼进行活体染色和标记，对动物的伤害非常小，可以最大限度地保证动物各器官组织的新鲜，具有其他荧光标记物无法比拟的优点，并且可以及时将完整的一条鱼在荧光显微镜下直接进行观察，此方法不仅简捷易操作，而且为我们能够对动物完整地进行经络观察，提供了形态学依据。

2 斑马鱼在疾病研究中的应用

由于斑马鱼作为模式生物的众多优点和与脊椎动物的相似性，斑马鱼已广泛应用于疾病的研究，包括肿瘤[5]、造血系统疾病、心血管疾病、眼科疾病、骨骼相关疾病、癫痫等神经系统疾病、药物成瘾等[6][7][8]。斑马鱼肿瘤在基因组学和组织病理等方面与人类肿瘤高度相似[9][10]。斑马鱼的应用进一步揭示了人类肾脏疾病相关基因的功能以及分子间的相互作用，这将有利于我们进一步阐明肾脏疾病发生的分 子机制[11]。随着科学技术的日新月异，整条观赏鱼可使用尼康等光学显微镜直接进行观察，从而可进一步利用转基因技术，使绿色荧光蛋白在特异性组织或器官上表达，有利于检测与观察[12]。

3 斑马鱼、锦鲤鱼、新月鱼在针灸经络研究中的应用

自中国中医科学院针灸研究所在2006年成立以来[1][2][3]，先后用DiA荧光素对斑马鱼、新月鱼、锦鲤鱼进行经络和穴位的专门研究，主要对神经系统进行了细致地观察；毛细胞是鱼类体表感受器的主要细胞成分，因此，本文中的荧光标记物即体表感受器及与之相连的神经纤维。

3.1 方法 首先将成年鱼活体放入30uM DiA水溶液中3小时，之后经10%乙醚麻醉，最后在荧光显微镜下观察。

3.2 结果

3.2.1 斑马鱼体表感觉器官分布有一定的规律性：若干感觉器官聚集在一起形成簇，若干簇又有规律地沿躯体长轴排成线，类似于传统经络与穴位。

3.2.2 在显微镜下，荧光标记物（锦鲤鱼体表感受器）呈亮圆点状，若干标记物聚集成簇，有规律地分布于体表各个部位。标记物在眼周围呈放射状，并且沿鳃盖前后缘有线性分布；在躯体部，标记物沿身体长轴呈线性排列，锦鲤鱼共约有14 条。长时间DiA浸染的锦鲤，在荧光镜下还可辨清与感受器相连的神经纤维走向。

3.2.3 新月鱼体表感受器呈亮圆点状，大多标记物单个分布，部分成簇分布（2～5个/簇），并且有规律地分布于体表各个部位；若干簇又有规律地沿躯体长轴排成线，类似于传统经络与穴位现象。

3.3 结论 斑马鱼、锦鲤鱼、新月鱼体表感受器的簇状分布及线性排列类似于中医的穴位与经络，其神经纤维趋向头侧并向体干侧线管前端汇聚，在体表形成一个以神经纵向走行为主的感觉系统，与经络的纵向传导相似，对经络研究有借鉴意义。

鱼类体表感受器可分为四类：感觉芽、丘状感觉器、侧线器官、罗伦瓮。其中丘状感觉器又称陷器或神经丘，由于其感觉细胞低于四周的支持细胞，因而形成中凹的小丘状构造，能感觉水流和水压。侧线器官是最高度分化的、鱼类及水生两栖类生物所特有的皮肤感觉器，呈沟状或管状，具有感觉水流、确定方位、辅助趋流性定向、感受低频率声波等功能[13]。神经丘是侧线的重要组成部分，典型的神经丘分布于鱼类头部或体干的沟槽或管道内（如侧线管），此外，也有游离分布的神经丘，但其分布尤其是在体干部的分布规律知之甚少。由于耳支是神经系统种系发生过程中鱼类和两栖类支配侧线器官的最后残留物，本研究首次应用活体荧光染色的方法观察，了解到锦鲤体表游离神经丘的分布规律，丰富了鱼类学的内容。

我们的实验认为：在动物的外周组织中到处都有神经网络[14]，躯干和四肢上的胆碱脂酶阳性小，神经束的神经末梢形成的神经网络多分布在小血管周丛。我们采用甲苯胺蓝染色法对肥大细胞[15]镜下观察显示，在经络皮部组织内，可见穴区真皮内肥大细胞的分布，皮下组织内肥大细胞存在脂肪组织中，集中于血管周围，肥大细胞数量最多。经典解剖学认为，迷走神经耳支是迷走神经末梢在周围皮肤的分支，中枢走行中有舌咽神经和面神经加入，属于一般躯体神经，投射到三叉神经脊束核。

经络理论是中医学的基础，数千年前中国古人就发现人体内存在气血密不可分的调控系统[16]，并称之为“经络”。经络由经脉和络脉组成，合称经络；“经”之路径，“络”之网络，像网络样的错综联结，遍及周身。

近半个多世纪以来，随着科学尤其是生命科学的进步，我国科研工作者对经络、腧穴理论进行了大量的研究，证实了经络现象的客观存在性，同时认为经络现象是普遍存在于人群之中的一种正常生命现象[16]，但至今仍未能发现经络和穴位存在的形态结构，现有的研究结果又很难完整地解释腧穴和经络现象。鉴于穴位是一种固有的生命现象，低等脊椎动物亦应存在穴位或类似结构。

前期研究工作已发现，斑马鱼、新月鱼、锦鲤鱼等均存在体表感受器的簇状分布与线性排列，类似于传统的穴位与经络，因此，应用低等脊动物锦鲤，以其体表感受器为研究对象，进行穴位与经络研究，以期运用比较生物学的方法，探讨穴位存在的生物学证据。

经络和穴位的研究一直是个热点和难点。穴位主要功能是感觉，针刺穴位所产生的酸、麻、胀、痛、热等针效均表现为感觉器官的反应。我们研究发现感觉器官在躯体的有规律的集中分布[1][2][3]，其功能上类似于穴位。最近研究发现感觉器官在多数鱼类中具有多种功能，如感觉平衡、水流方向、速度、信息交流、群体活动、交配、捕食和逃避被捕食等，部分鱼类的此类器官还可以放电和发光。中医对经络的经典描述，在躯干部分与本研究所观察到的感觉器官所形成的线有相似之处，都形成若干条线。因此，有研究者推测，斑马鱼存在类穴位与类经络结构；斑马鱼皮肤感觉器官并不是均匀地分布于全身，而是若干感觉器官聚集在一起形成有规律的簇，而若干簇又有规律地沿躯体长轴排成线，类似于传统经络与穴位。

既然透明斑马鱼等（观赏鱼类）神经系统分布有规律可寻，那么，我们就有充分的理由对其机理研究进行大量的、更加深入的挖掘工作。国外对斑马鱼在遗传基因[17]等方面研究已有相关报导。目前，在国内将观赏鱼类用于经络研究还只是刚起步，今后还有大量工作等待我们去完成。

4 展望

最近美国科学家成功培育出一种透明斑马鱼，他们称这种透明斑马鱼可以直视鱼的内部器官，实时地观测活体器官的生长过程。此新培育出的斑马鱼会在整个生命过程中保持通体透明。斑马鱼是目前生命科学研究中重要的模式脊椎动物之一。

自20世纪90年代初，斑马鱼因其多方面的优点已成为医学模式动物家族中重要的一员，受到越来越多地重视和利用，使得人类不断发现一些新的研究成果。斑马鱼作为模式生物有以下优点：斑马鱼是脊椎动物，有独立的组织器官如脑、感受器、心脏、肝、胰、肾、肠、骨、肌肉等，且其器官与人体器官在结构、生理、分子水平等方面有着惊人的相似点；个体小，喂养和费用便宜，所需空间场地不大；胚胎透明，完整的活体可观察到所有内部器官和结构，可以避免杀死或解剖动物，从而可多角度对其进行观察。此外，雌性斑马鱼可产卵200枚，胚胎在24小时内就可发育成形，这使得生物学家可以在同一代鱼身上进行不同的实验，对于疾病机制的研究非常有益。

综上所述，斑马鱼、锦鲤鱼、新月鱼的皮肤作为一种直观感觉器官，具有其他器官无法比拟的优势，由于神经系统是所有器官组织中最复杂的系统，而皮肤却直观可视，尤其是透明观赏鱼类不仅美观大方，而且可以直视鱼的内部器官，也为神经系统的可视性研究提供了可靠保障。我们通过对透明斑马鱼等实验研究切实体会到，虽然存在困难和阻力，但是，它仍然具有其他实验动物无法比拟的明显优势。我们相信随着中医针灸事业的不断发展，斑马鱼等将在针灸经络研究领域为中医事业作出自己应有的贡献。