小肠上皮细胞的培养及在动物营养上的研究进展

王清静 张 恒 龙民慧 王 蕾 张金凤

小肠黏膜上皮细胞(intestinal epithelial cells，IEC)是肠道内重要的功能细胞，在营养物质消化、吸收、转运及消化酶分泌、免疫屏障和应激反应等方面都发挥着重要作用，并与肠道的内、外分泌功能有密切关系。小肠黏膜上皮细胞的体外培养已成为研究肠道营养物质吸收、利用及转化，细胞间信号转导以及肠道免疫屏障功能的主要手段之一[1]，为研究小肠上皮细胞相关的生物学功能提供了理想的试验模型。本文简述了小肠上皮细胞培养的有关方法及在动物营养上的研究进展。

1 小肠上皮细胞培养

1.1 原材料的选择

体外培养小肠上皮细胞对原材料的要求非常严格，多取材于增殖能力强、污染少的胚胎或新生动物，因其小肠黏膜组织稚嫩、结构疏松容易分离培养。匡伟(2007)[2]用新生白山羊的十二指肠组织，进行小肠上皮细胞的培养，成功建株。马玉龙等(2007)[3]以18日龄鸡胚的肠组织为原材料，消化后收集小肠上皮细胞进行培养研究，获得了大量细胞团。成体肠黏膜上皮细胞很少用于培养，因其在体外培养几天后会凋亡，稳定传代极为困难，难以构建长期存活的细胞试验模型。

1.2 小肠上皮细胞的分离

1.2.1 机械破碎法

先用磷酸盐缓冲液(PBS)和无血清的DMEM培养液清洗小肠组织，然后将其剪成＜1 mm3的碎片，培养数天，组织块周围即可辐射生长出大量的单层细胞，主要是上皮细胞和成纤维细胞。该方法简单易操作，获得的细胞活性和增殖能力较强，但成纤维细胞污染严重，需进一步从中挑选出上皮细胞进行纯化培养。

1.2.2 酶学消化法

酶学消化法是利用化学的方法去掉组织中的细胞间质，使其分散成单个细胞制成细胞悬液进行培养，细胞本身不受伤害。常用的酶有胰蛋白酶、胶原酶、中性蛋白酶、透明质酸酶等。

1.2.2.1 胰蛋白酶(Parenzyme)

该酶是肽链内切酶，它能把多肽链中由赖氨酸和精氨酸构成的羧基侧切断，使细胞间的蛋白质水解，细胞离散，是特异性最强的蛋白酶。但因消化能力较强，常常会损坏细胞，导致细胞的贴壁率很低。廖贤平等(1998)[4]用胰蛋白酶消化组织块，培养人类小肠上皮细胞，得到的细胞大部分为单细胞或较小的细胞团块，贴壁和生长能力较差。

1.2.2.2 胶原酶(Collagenase)

一般是从芽孢杆菌中提取制备，主要水解结缔组织中胶原蛋白成分，对细胞间质有消化作用，而对上皮细胞影响不大。当消化的组织较硬，内含较多结缔组织或胶原成分时，用胰蛋白酶解离细胞的效果会较差，采用胶原酶解离细胞法就可以取得很好的效果。马玉龙等(2007)[3]分别采用1 g/l胶原酶Ⅰ和1 000 U/ml胶原酶Ⅺ消化分离鸡胚肠上皮细胞，结果发现，经1 g/l胶原酶I消化70 min后所获得的多为细胞团、少量肠隐窝器官样细胞团和单细胞，细胞贴壁好，生长良好。胶原酶主要水解细胞间质的脯氨酸多肽离散细胞，其消化的是细胞间质而不是细胞表面，因此不会损伤细胞膜，不会影响细胞的存活率及贴壁率，但由于个体差异，探索最佳消化时间和浓度需要较长的时间。

1.2.2.3 噬热菌蛋白酶(Thermolysin)

主要水解非极性氨基酸的氨基端肽键，可用来从真皮中分离角质细胞，用噬热菌蛋白酶来分离消化小肠上皮细胞的最大优点是保持了上皮细胞的活性和增殖能力。张道杰等(2004)[5]用嗜热菌蛋白酶消化分离人的胎儿肠上皮细胞，接种于DMEM培养液内，纯化后，成功地进行了传代与鉴定。噬热菌蛋白酶能分离较多的健全绒毛隐窝单位，而健全绒毛隐窝单位分离是维持IEC体外生长繁殖的一个关键因素[6]，培养的IEC较纯，但是增殖缓慢。联合使用噬热菌蛋白酶和胶原酶Ⅰ可分离出较纯的上皮细胞，缺点是分裂数次后便停止分裂。

1.2.2.4 其他

与使用单种酶相比，使用复合酶有时可以取得更好的效果。复合酶可降低消化酶的浓度，减轻酶对细胞的损害毒性，缩短消化时间。马玉龙等(2007)[3]使用多种酶分离18日龄鸡胚肠上皮细胞，发现低浓度的胶原酶Ⅺ型和中性蛋白酶Ⅰ型联合作用35 min，得到大量肠隐窝器官样细胞团、部分细胞团和少量单细胞，细胞贴壁能力较强，生长良好，而单独使用0.5 g/l中性蛋白酶消化70 min后所收获的多为细胞团、少量肠隐窝器官样细胞团和单细胞；细胞能贴壁，但生长不良。王海霞等(2007)[7]使用多种酶分离新生徐淮白山羊羔羊小肠上皮细胞，也发现胶原酶Ⅺ和中性蛋白酶I分离30 min后即可见大量绒毛隐窝单位，l～2 d绒毛隐窝单位贴壁，开始“长出”梭状细胞，并向周围蔓延，长出的细胞大部分是小肠上皮细胞。

1.2.3 非酶学消化法

EDTA(乙二胺四乙酸)是常用的非酶性消化物，通过螯合溶液中的二价阳离子破坏细胞紧密连接以达到消化效果，其作用温和，多用于解离单层细胞。Pedersen等(2000)[8]分离人类结肠上皮细胞，用EDTA和EGTA分别处理10 min和60 min，结果表明，10 min即可获得完整的隐窝细胞，细胞活力优于处理60 min获得的上皮细胞，其纯度也高于酶消化法。EDTA对细胞的毒性主要取决于摩尔浓度、温度和作用时间。当摩尔浓度大于10 mmol/l时，EDTA对细胞产生的毒性较强[9]。其原因是EDTA和EGTA作用较缓和，单独消化新鲜组织时很少使用，一般结合其他酶联合使用。

1.3 纯化

纯化是一个去除异源细胞的过程。少量的异源细胞对IEC的生长繁殖有利，但过度繁殖却会起抑制作用[10]。一般的纯化主要是去除成纤维细胞，常用的方法有机械刮除法、相差消化法和相差贴壁法。

1.3.1 机械刮除法

当上皮细胞被大量集中的成纤维细胞包围生长时，常用该方法除去成纤维细胞的污染。具体方法是：在显微镜下，用记号笔将培养皿中上皮细胞的集落区域勾画出来，用刮子或灭过菌的枪头直接将弃去的细胞区域刮除，用培养液或PBS洗涤后，将上皮细胞用酶消化下来，在新的培养瓶中继续培养，必要时可重复上述刮除过程，即可达到纯化目的。刮除法效果明显，但常对细胞造成一定的机械损伤，因此，应将上皮细胞区域适当画大，且要注意在超净工作台上操作，防止污染。

1.3.2 相差消化法

上皮细胞与成纤维细胞夹杂生长时，可用相差消化法纯化。由于上皮细胞和成纤维细胞对酶的耐受性不同，可用胶原酶处理一次后在显微镜下观察，成纤维细胞先被消化下来，吸去上部培养液，用PBS洗涤后再次用酶消化，此时消化下来的细胞大部分是小肠上皮细胞。

1.3.3 相差贴壁法

相差贴壁法是基于成纤维细胞比上皮细胞贴壁快的特点来分离两类细胞以达到纯化的目的。具体方法是将细胞悬液接种在培养瓶中培养5～10 min后，吸出全部培养液，再接种到第二个培养瓶中。如有必要，可反复多次，至小肠上皮细胞纯化为止[9]。也可将细胞在37℃、5%CO2的培养箱中孵育2 h后，小心移除未贴壁生长的异源细胞[11]。

此外还有克隆板克隆法、克隆环分离法、3T3细胞饲养层法[9]等方法，具体实验中应灵活选用各种方法，以达到纯化的目的。

1.4 细胞系的建立

分离纯化后的上皮细胞生长到相互汇合时开始传代：先用PBS清洗贴壁的细胞，然后加入rypsin-EDTA消化液，使细胞与瓶壁分离并相互散开，当细胞回缩呈圆形时，迅速用含有血清的培养基 (FBSDMEM/F12)终止消化，离心，弃去上清液，用血清培养基重新吹打悬浮细胞，计数，移植到新的培养瓶中增殖，完成细胞系建立。

1.5 IEC的鉴定

1.5.1 形态学检查

福尔马林固定小肠组织，HE染色后，在倒置显微镜下，常规观察细胞生长状态和形态特征，拍照记录后与现有的小肠上皮细胞进行对比。正常的仔猪小肠上皮细胞由单层立方形细胞及扁平多角状细胞构成，胞质比较丰富，核为圆形或者椭圆形，核内染色质稀疏空亮，核仁 1～2 个[12]。

1.5.2 免疫组织化学检测

免疫组织化学是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。肠上皮细胞可产生特有的表达产物细胞角蛋白[1]，对细胞进行免疫组织化学染色，通过结果的阳性和阴性，可进一步鉴定小肠上皮细胞。

1.5.3 电镜法

细胞桥粒和刷状缘是上皮细胞典型的结构特征，通过电子显微镜扫描观察可鉴定上皮细胞。先用戊二醛固定，乙醇脱水，乙腈干燥，制得标本后观察鉴定。

2 小肠上皮细胞培养在动物研究中的应用

2.1 猪

小肠上皮细胞培养方法的建立，为研究猪肠道营养的消化吸收、免疫屏障、肠道病毒性及细菌性疾病提供了便利。王静等(2010)[12]使用多种酶消化法分离肠上皮细胞，利用组织块培养法成功建立了能够连续传代的新生仔猪小肠上皮细胞株，获得的细胞活力较好，增殖能力较强，为研究猪的肠道生理提供了可靠的试验模型。陈思怀等(2008)[13]研究了氟对体外小肠上皮细胞的影响，研究表明，当氟添加量＜10.0 μg/ml时，细胞的增殖、碱性磷酸酶活性无明显改变；而高氟组(20.0 μg/ml)小肠上皮细胞的增殖、碱性磷酸酶活性受到显著抑制，并且小肠上皮细胞的形态由多角形变为圆形，细胞核溶解，大部分细胞死亡，为进一步研究氟对体外小肠上皮细胞的危害机理奠定了基础。

2.2 牛和羊

葡萄糖和谷氨酰胺(Glutamine，Gln)是肠道黏膜细胞代谢的能源物质，当动物处于疾病等应激状态时，肠道对葡萄糖的摄取明显下降，对Gln的利用显著增加，即应激小肠能量代谢对Gln具有依赖性，同时Gln是细胞分化增殖所必需的营养物质。周玉香等(2009)[14]对早期断奶犊牛小肠上皮细胞进行分离和体外培养，研究Gln和葡萄糖对早期断奶犊牛小肠上皮细胞能量利用的影响。结果表明，在体外培养液中加入血液水平2倍的Gln，有利于早期断奶犊牛小肠上皮细胞生长，促进三磷酸腺苷(ATP)的合成和能量储备，为保护犊牛肠道健康提供理论依据。彭春燕等(2010)[15]通过培养山羊小肠上皮细胞研究氨基酸的代谢利用状况，结果表明，组氨酸、精氨酸、苏氨酸和亮氨酸是小肠上皮细胞快速利用的氨基酸，其含量在72 h内快速下降；天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、脯氨酸是生成的氨基酸，在72 h内有所积累；其它氨基酸呈现平缓的被消耗状态。

2.3 家禽

小肠上皮细胞培养技术在鸡和鹅上也已成功建立，家禽肠液的pH值范围为7.39～7.53，培养基的pH值最好控制在此范围内[16]。生长因子对于细胞的增殖分化具有十分重要的作用，在培养液中添加胰岛素、胰岛素样生长因子和表皮生长因子可有效促进IEC的增殖。杨文平等(2007)[17]培养1月龄三黄鸡IEC发现，配合使用胰蛋白酶EDTA，可获得大量的健全肠绒毛隐窝单位。通过组织块种植法和酶消化法进行原代鹅小肠上皮的体外培养的比较。李融等 (2009)[18]发现，组织块种植法得到的鹅小肠上皮细胞生长状况良好，活性强、纯度高，为肠道细胞的进一步研究奠定了基础。

3 展望

细胞的体外培养技术是分子生物学的一项重要技术，该技术与多种现代科学技术相结合应用于生命科学的各个研究领域。体外试验相对于体内试验，具有简化细胞生长环境、节省饲养动物的成本、明确细胞生长条件、便于施加各种试验因素、可直接观测结果及方便控制培养产物等优点，应用越来越广泛。但目前，研究主要集中于鼠或人的肠上皮细胞系，仅局限于人类生物制药方面，而为人类提供肉、蛋、奶等畜禽类的动物细胞营养方面的研究报道较少，因此，小肠上皮细胞培养在动物营养上的应用有很大的发展空间。

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