术中应用OSNA技术检测乳腺癌前哨淋巴结转移的临床意义

刘娟娟，孙 晓，李太玉，王永胜，宋现让，仲伟霞，周长春，穆殿斌，周正波，李永清

(山东省肿瘤防治研究院，济南250117)

乳腺癌前哨淋巴结活检术(SLNB)已经替代腋淋巴结清除术(ALND)成为临床腋淋巴结阴性的早期乳腺癌患者的标准处理术式［1，2］，前哨淋巴结(SLN)的诊断技术是SLNB的关键技术之一。2010年2～6月，我们应用一步核酸扩增(OSNA)对113例乳腺癌患者的SLN进行检测，对照术后常规病理检测结果，评估OSNA检测在SLN术中的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 本文共入选113例乳腺癌患者，均为女性，年龄29～82岁，中位年龄47岁。术前均病理诊断明确，符合SLNB适应证并自愿接受SLNB。其中，浸润性导管癌69例，浸润性小叶癌13例，导管内癌7例，其他类型28例。按照山东省肿瘤医院伦理委员会批准的研究方案和赫尔辛基宣言，每例入选患者均在知情同意书上签字。先前曾接受过新辅助化疗和同侧腋窝手术的患者，本项研究不予纳入。

1.2 方法

1.2.1 SLN处理 按SLN的质量及短轴长度进行切分，若SLN质量小于100 mg，则不进行切分;SLN术中同时行快速冰冻病理(FS)检测，术后行常规病理检测。SLN质量100～1 200 mg，则进行切分。若SLN短轴长度小于4 mm，则切分为2枚组织块，术中均行印片细胞学(TIC)检测后，1枚组织块行OSNA检测，另1枚行FS检测，术后FS检测组织块剩余组织行常规病理检测;若短轴长度在4 mm以上，则切分为4枚组织块，术中均行TIC检测后，奇数组织块行OSNA检测，偶数组织块行FS检测，术后FS检测组织块剩余组织行常规病理检测。术中FS、TIC、OSNA检测任一阳性者，即转行ALND。

1.2.2 OSNA检测 OSNA检测基于逆转录—环状介导等温扩增原理，通过对SLN中CK-19的测定，快速检测大于0.2 mm的转移灶。检测的操作人员均参加一项为期2 d的培训，在对患者的淋巴结样品进行检测前，已使用Sysmex公司提供的样本通过了熟练操作测试。先用LYNOAMP BC试剂创建标准曲线，后将SLN组织块进行匀浆，随后将引物、CK-19、酶、CK-19阴性及阳性质控、淋巴结原倍及稀释样本放入RD-100i OSNA Assay进行扩增。OSNA检测的(++)、(+)及出现反应抑制结果被判定为SLN阳性。

1.2.3 常规病理检测 该诊断作为SLN诊断的金标准，切片厚度为4～6μm，每个SLN组织块取4张切片。本研究中，SLN中大于0.2 mm的转移灶定义为SLN阳性，仅有孤立肿瘤细胞团(ITC)者定义为淋巴结阴性。采用的诊断标准为2002年第6版美国癌症联合委员会肿瘤分期，＞2 mm的转移灶定义为宏转移，0.2～2 mm的转移灶定义为微转移，＜0.2 mm的转移灶定义为ITC。

1.2.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件，不同检测方法之间诊断效率差异采用χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

113例患者中，37例常规病理检测阳性，43例OSNA检测阳性。11例OSNA检测假阳性病例，5例假阴性病例。OSNA的准确性为85.8%(97/113)，其敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别为 86.5%(32/37)、85.5%(65/76)、74.4%(32/43)、92.9%(65/70)。

FS的准确性为95.6%(108/113)，其敏感性、特异性分别为86.5%(32/37)、100%(76/76);TIC的准确性为92.0%(104/113)，其敏感性、特异性分别为 91.9%(34/37)、92.1%(70/76)。OSNA 的敏感性与 FS(P=1.00)及 TIC(P=0.454)相似。

对于SLN宏转移患者，OSNA的敏感性则为90.6%(29/32)，FS和 TIC 的敏感性分别为 90.6%(29/32)和 96.9%(31/32)，三者表现相似(P=0.161)。对于SLN微转移患者，OSNA和TIC的敏感性均为60.0%，显著高于 FS(0)(P=0.038)。

3 讨论

SLN的术中诊断可使SLN阳性患者通过一次手术完成ALND，避免二次手术，降低了二次手术的风险和费用。当前，SLNB已成为除炎性乳腺癌以外的临床腋淋巴结阴性的浸润性乳腺癌患者的标准手术方式［3］，其适应证的扩大对术中诊断提出了更高的要求。目前国际上和国内普遍使用FS和TIC作为术中诊断的检测方法［4］。FS和TIC的主观性较强，当存在微转移时容易漏诊。van de Vrande等［5］报道，FS对大体转移和微转移的敏感性分别为84%和61.1%。荟萃分析显示，TIC对二者的敏感性分别为81%和22%［6］。本研究FS和TIC的敏感性分别为86.5%和91.9%，二者对微转移的敏感性分别为0和60.0%。相对于传统的将SLN切分为二进行检测的方法，本研究采用的方法显著提高了FS和TIC的敏感性，这是本研究FS及TIC的敏感性高于文献报道水平的重要原因。

CK-19是上皮细胞的标志基因，可作为乳腺癌在淋巴结转移的标志物，OSNA检测基于逆转录环状介导等温扩增原理，快速检测淋巴结中CK-19的表达，该技术具有无需mRNA纯化、应用6个引物提高特异性的优势。Tsujimoto等［7］的研究首先显示，OSNA检测 SLN的准确性为96.4%，CK-19是OSNA检测的最佳基因，可根据其阈值进行半定量检测。Visser等［8］的研究显示，OSNA检测的准确性、敏感性和特异性分别为 96.8%、94.7%、97.1%。本研究结果与文献报道相似。

目前，多个指南均推荐将SLN切分为2 mm左右厚度的组织块后进行连续切片或逐层切片。美国肿瘤学会推荐对每个2 mm厚的组织块在第1层面基础上间隔 200～500μm 再切1～2个层面［9］。90%的欧洲研究机构对SLN进行连续切片［10］。连续切片只能评估约5%的SLN组织。受国情影响，大部分国内医院对SLN仅行单个层面HE染色切片，容易漏诊微转移灶，具有更高的假阴性率。相比之下，OSNA可对100%的SLN组织进行检测，克服了常规病理检测方法存在取样误差的不足。同时，OSNA检测易于掌握，避免了主观因素的干扰。

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