猪细小病毒的研究进展

王冠 (山东省畜牧兽医信息中心 济南 250022) 代小芳 谢之景 （山东农业大学动物科技学院 泰安）



猪细小病毒的研究进展

王冠 (山东省畜牧兽医信息中心 济南 250022) 代小芳 谢之景 （山东农业大学动物科技学院 泰安）

猪细小病毒病是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一，由猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)感染引起的，可以导致初产母猪及血清学阴性的经产母猪发生流产、不孕、产死胎、木乃伊胎及弱仔等。同时还可以引起仔猪非化脓性心肌炎(Bolt，1997)、皮炎症状(Kelly，1994)及消瘦性综合征(Krakowka，2000)。该病广泛存在于世界各大猪场，给养猪业带来了巨大的损失。

1 猪细小病毒病原学研究

1.1 PPV的形态和理化学特点 PPV属细小病毒科细小病毒属，二十面体等轴立体对称，无囊膜，直径约20~26nm。衣壳由32个壳粒组成，核心含单股负链DNA。

PPV具有耐酸性和耐酶性，在pH3~9的条件下稳定。胰酶短时间(如1h)的处理，对其感染性没有影响，反而能提高其感染效价，这可能是由于胰酶使病毒粒子在悬液中进一步分散的结果。PPV耐热，56℃处理48h或70℃ 2h后仍能部分保持感染力和血凝活性，但80℃经5min加热即可丧失活性。Mary等(1969)的研究表明：病毒在4℃极为稳定，可长期保存，在-20℃和-70℃下经1年以上的保存，其感染效价和血凝性都不改变。PPV对木瓜蛋白酶、胃蛋白酶及核糖核酸酶，以及对脂溶剂如乙醚、三氯甲苯、醇和脱氧胆酸钠均有一定的抵抗力。

对各种消毒剂有很强的抵抗力，甲醛蒸汽和紫外线需要相当长的时间才能杀死PPV，0.5%漂白粉或氢氧化钠5min可杀死PPV，2%戊二醛则需要20min左右，3%甲醛则需要2h。PPV具有血凝性，能凝集豚鼠、大鼠、小白鼠、恒河猴、猫、鸡和人O型红细胞，其中对豚鼠的红细胞的凝集最好，不能凝集牛、仓鼠和猪的红细胞。鸡红细胞对PPV的敏感性有个体差异，不同的生理状况、遗传特性和年龄会影响实验的结果。此外，PPV的血凝活性还依赖于反应的温度，在4℃可以获得最高的反应滴度。

1.2 病毒分型 按照致病性与组织嗜性大致可分为4个类型。第1类以NADL-2株为代表，可以用作弱毒疫苗来防制PPV感染，但通过子宫接种有复制和感染的能力；第2类是以NADL-8株为代表的强毒株，口服接种能够穿过胎盘屏障，造成胎儿感染，形成病毒血症；第3类是以Kresse株为代表的皮炎型强毒株，可以致死免疫不充分的胎儿；第4类以AF-83株为代表的肠炎型毒株，主要引起肠道的病变。虽然存在不同的PPV毒株，但是目前认为PPV只有一个血清型。

1.3 PPV的生长特性 PPV只能在来源于猪的细胞(如原代猪肾细胞、猪睾丸细胞和传代系PK-15和人的某些传代细胞(如Hela、KB、HEp-2、Lul32等细胞)中增殖，其中以原代猪肾细胞较为常用。但Vasudevacharya等(1992)报道，在犬系A-72细胞的培养过程中，曾被PPV病毒污染过，且在此细胞上出现了明显的变化，这可能是由于病毒在结构基因和非结构基因处有几个碱基发生变异，致使局部拓扑学发生改变而引起的。因为PPV的增殖需要细胞源DNA多聚酶，因此要获得大量的病毒并出现明显的细胞病变，一般在多数细胞都处于细胞繁殖周期的S期，即DNA合成期时进行病毒的接种。

此外，培养的温度对PPV的生长也有一定的影响。Choi(1989)将NADL-8、NADL-2、KBSH和Kresse分别在32、37、39℃进行培养，结果：NADL-8、NADL-2在3个温度下没有明显的差别；Kresse株在32℃、37℃时生长受到限制，在39℃时没有影响。而KBSH株则正好相反，在39℃培养时，细胞生长受限制，而在32℃、37℃时细胞生长不受影响。体外复制温度的差异可以解释不同分离株在猪体内复制能力和毒力的差异。

2 流行病学及流行状况

2.1 流行病学 各种品系的猪及不同日龄的猪均可感染，猪以外的其他动物不易感染。据报道，在牛、猫、绵羊、豚鼠、小鼠和大鼠中均能检测到PPV的特异性抗体，兔感染后可致其流产、死产，这表明PPV的宿主范围在扩大，感染谱逐渐加宽。感染的公母猪是主要的传染源，病毒可经胎盘传播给胎儿，形成垂直传播；通过消化道和呼吸道感染也是猪群感染PPV的主要方式。Lucas等(1974)在被感染的公猪的睾丸内发现了PPV，并证明能通过交配传染给母猪。

该病一般呈地方流行性或散发，在初次感染的猪场往往呈暴发性流行。由于PPV感染性强，且对外界环境及许多消毒剂都有一定的抵抗力，一旦侵入健康的猪群，在三个月内，几乎导致100%的感染。Fujiska等(1975)报道：在该病发生后的猪场，能持续几年甚至十几年不断出现生殖失败。

2.2 流行状况 PPV在世界各地的猪群中普遍存在，近年来，随着规模化养猪的发展，PPV的感染呈现扩大的趋势，目前，想要寻找到PPV阴性的猪群已经比较困难。

从60年代中期分离病毒并逐步确定其致病性以来，相继已在比利时(1967)、德国(1968)、日本(1972)、美国(1972)、荷兰(1972)、澳大利亚(1973)、南非(1975)、芬兰(1979)、法国(1977)及加拿大(1978)、巴拿马(1987)等国相继报道(赖笑娴，2010)。1982年由中国兽药监察所首次在国内分离到该病毒。此后在上海(潘雪珠等，1983)、吉林(侯世宽等，1983)、四川(邬捷等，1985)等地都分离到PPV。

3 PPV的诊断与防制

3.1 诊断 可根据临床症状和流行病学做出初步的诊断。一般认为，如果仅妊娠猪发生流产、死胎、木乃伊胎、胎儿发育异常，同时有证据表明是传染性疾病时，则应考虑到PPV感染的可能。但进一步确诊必须进行实验室诊断(朱润芝，2005)。病毒分离和鉴定是PPV感染最为确切的诊断方法。通常采取可疑的流产和死产胎儿的肾、肺、肝、脑、睾丸和胎盘等，其中以肠系膜淋巴结和肝脏的分离率最高(殷震，1997)。但是此方法费时费力，并且需要一定的技术条件和设备，从而限制其在临床上的应用。血清学检测方法主要有血凝(HA)和血凝抑制试验(HI)，该法操作简单，但灵敏度低，只能作为辅助诊断的方法；血清中和试验(SN)的特异性高于HI，但其操作时间长，用于临床的时效性太差；酶联免疫吸附试验(ELISA)的实验结果与HI一致且可用于毒大量的血清进行检测，具有省时、准确的优点；乳胶凝集试验适用于临床上的现场检测，有良好的应用前景；免疫荧光抗体技术(FAT)是一种精确性的技术，但存在非特异性染色的问题；对流免疫电泳具有简便、快速、稳定的特点，有一定的推广价值；此外还有银加胶体金技术(SECGA)、琼脂扩散试验、免疫电镜试验等。随着分子生物学技术的不断发展，已经建立了许多更加敏感的诊断方法。核酸探针技术、PCR技术、单克隆抗体技术等都具有快速、特异性强及灵敏度高等特点。综上所述，猪细小病毒病的诊断方法很多。相对而言，目前临床上应用较多的是血清学诊断技术，特别是HA和HI试验，这两种方法基本能满足常规的病原检测和血清流行病学调查等需要。但要确诊还需利用病毒分离鉴定方法。而分子生物学诊断方法灵敏度高、特异性好，检测快速，结果可靠，随着条件的完善，将会得到更广泛的应用。

3.2 防制 同其他的许多病毒病一样，该病目前还没有有效的治疗方法，主要以预防为主。由于PPV的血清型单一及其具有高免疫原性，使得疫苗接种成为控制PPV感染的一种行之有效的方法，于繁殖前给母猪接种疫苗是世界上大部分地区共用的方法。（1）疫苗：常用的弱毒疫苗主要有NADL-2弱毒株(Mengeling，1986)、HT变异株(Fujisakl，1982)、HT-SK-C株(Akihiro，1986)、N株(蒋玉雯等，1992)等。在国外多用NADL-2株，在国内主要用N株。此外，叶向阳等(1996)将PPV通过ST细胞上连续传代获得弱毒株，经安全性试验证实该毒株有良好的安全性及制成的疫苗有良好的免疫性。虽然已有多株弱毒疫苗在临床上得到了应用，但存在病毒重组及弱毒返强的危险，使得弱毒苗的应用受到一定的限制。而灭活疫苗一直被认为是研制周期最短、最为安全可靠的疫苗。自1976年国外就有关于PPV灭活疫苗的研究报道，20世纪80年代在美国、法国、澳大利亚等国家已普遍应用。在我国，潘雪珠(1983)等学者也成功研制出PPV灭活疫苗。PPV疫苗研制中常用的灭活剂有福尔马林、ß丙内酯(ß-PL)、N-乙酰乙烯亚胺(AEI)及二乙烯亚胺(BEI)等；常用的佐剂有氢氧化铝和油水乳剂。由于联苗可以简化免疫程序，降低临床应激反应，适合规模化养猪生产的发展趋势，现有的灭活联苗有PPV-PRV(Mengeling，1980；邬捷等，1988；)、PPV-JEV(姜天童等，1996)等，动物实验均表明两种病毒抗原同时刺激机体时未发生干扰作用。尽管PPV的弱毒苗和灭活苗在猪细小病毒病的预防控制中起到了十分重要的作用，但均存在不同程度的缺陷。如弱毒疫苗有发生重组及毒力返强的潜在威胁；而灭活疫苗有产生抗体的时间较长，免疫效果不稳定等。因此，寻找更为安全有效的疫苗一直是学者们的研究热点。分子生物学技术的发展给新型的PPV疫苗的研制和开发提供了良好的契机，主要有基因工程亚单位疫苗、基因工程多价亚单位疫苗、基因疫苗、以病毒为载体的重组活疫苗、转基因植物可饲(食)疫苗等。（2）目前我国已经取得新兽药证书的PPV疫苗有：上海农科院畜牧兽医研究所研制的PPV油乳剂灭活疫苗(三大类新兽药，(94)新兽药证字第04号)，华中农业大学、武汉科前动物生物制品有限责任公司、中牧实业股份有限公司联合研制的PPV灭活疫苗(WH-1株)(三大类新兽药，(2006)新兽药证字第71号)，.农业部2005年4月统一核发文号之前，各地取得PPV疫苗的文号有6个(桂生药字(2003)191138；皖生药字(2001)111138；农生药字(2001)561138；黑生药字(2002)071138；辽生药字(2001)051138和晋生药字(2002)031138)(占利宾，2009)。（3）PPV疫苗的免疫程序：PPV的免疫主要以体液免疫为主，Mary和Cartwright报道，人工接种后6~9d，猪血清中即有抗体出现，14~21d抗体滴度达到1:1024~4096，大于70d的胚胎感染PPV，也可产生同样高效价的抗体。仔猪出生后，随年龄的增长而逐渐下降，到6~8月龄已检测不到抗体，此时的初产母猪最容易感染PPV(黄秋月，2003)。Paul(1986)等发现猪群在接种PPV灭活苗时，母源抗体水平低的猪与血清学阴性猪的免疫应答一样，而中等水平的母源抗体对疫苗免疫有轻微的干扰作用，高效价抗体对疫苗有明显的干扰作用。吕建强等(2002)进行了PPV母源抗体对灭活疫苗免疫效果影响的研究，结果证实不论母源抗体水平高低均不会明显抑制疫苗的主动免疫反应，但是主动免疫的抗体反应规律与猪体内的母源抗体的效价有关系。在母源抗体滴度大于1:149.5时，灭活疫苗接种后抗体水平先降后升，升幅为1~3倍；而母源抗体小于1:25.6时，主动免疫抗体一直持续上升，母源抗体阴性猪的抗体增幅最大。免疫接种的最佳时间是在初产母猪怀孕前的几周内进行，以便在怀孕的整个敏感期都产生免疫力。对于初产母猪的免疫接种的时机多为5~6月龄，此时母源抗体已基本消失，不会干扰主动免疫的形成，如不急于配种，最好可延至7月龄免疫，因为有少量的后备母猪的母源抗体消失的速度较慢，但母源抗体一般不会超过7月龄(赵以云，2009)。

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（2011–09–27）

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