表没食子儿茶素没食子酸醋对人胃癌细胞迁移、侵袭和cripto蛋白表达的影响

(江苏大学附属人民医院，江苏镇江 212002)

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率较高，主要原因是发现时即已有癌细胞侵袭和转移。茶多酚是茶叶中三十多种多酚类物质的总称，是一种从绿茶中提取的纯天然混合物，主要由四大类物质组成，其中以儿茶素最为重要，占多酚类总量的60% ～80%，儿茶素类主要由表没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯等几种单体组成，其中以EGCG的含量最丰富。研究发现，EGCG在体内外对许多肿瘤细胞增殖具有抑制作用［1～5］，但是对胃癌细胞侵袭研究甚少，抗癌机制亦不完全清楚。2012年1～3月，我们观察了EGCG对人胃癌细胞迁移、侵袭的影响，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 EGCG(Sigma公司)，用二甲基亚砜(DMSO)配成储液，－20℃冰箱保存;实验时用RPMI1640培养基稀释，DMSO的最终浓度＜0.9%;人胃癌BGC823细胞株，本院组织细胞生物库冻存，购自中科院上海细胞所细胞库;Trizol试剂购自Invitrogen公司;BCA蛋白分析试剂盒购自Pierce公司;基底膜胶购自BD公司。RPMI1640、新生小牛血清均购自Gibco公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及处理 人胃癌BGC823细胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640液中，37℃、CO2培养箱中培养。每日观察，待细胞至对数生长期，实验组加入20、40、80 μmol/L 的 EGCG 处理，对照组以RPMI1640代替EGCG处理细胞，备测。

1.2.2 细胞迁移能力检测 采用划痕法。先用marker笔在6孔板背后，均匀划横线，每隔0.5～1 cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。取对数生长期细胞消化、计数，使用培养基配制成浓度为8×105个/mL的细胞悬液，6孔细胞培养板中每孔加入1 mL细胞悬液，放入37℃，5%CO2培养箱中培养直至细胞铺满单层。用100 μL枪头沿培养板底部呈“一”字形划痕;用枪头尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。弃去培养基，用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，用培养基稀释药物至所需浓度，每孔加入1 000 μL相应的含药培养基，同时设立阴性对照组;6孔细胞培养板置于37℃，5%CO2培养箱中培养24 h，拍照。记录细胞迁移距离。

1.2.3 细胞侵袭能力检测 采用Transwell法。上下室之间铺聚碳酸醋微孔滤膜(孔径8 μm)，滤膜上包被有Matrigel。制备ECM gel小室:将ECM gel置于4℃预冷2 h，Transwell小室上室加入ECM gel 50 μl，置于37 ℃，5%CO2培养箱内直至 ECM gel凝固为止。制备细胞悬液:撤去血清饥饿细胞24 h，消化细胞，计数，用含0.1%FBS的培养基重悬细胞，调整细胞浓度为1×106个/mL。下室加入500 μL含20%FBS和相应浓度Endostar的培养基，上室加入100 μL密度为1×106个/mL的细胞悬液，ECM gel小室置于37℃，5%CO2培养箱内培养36 h。擦去小室上表面细胞，24孔板中每孔加入0.5 mg/mL的MTT 500 μL，将小室置于其中，使膜浸没在培养基中，37℃ 4 h后取出，每孔加入 DMSO 500 μL，将小室置于其中，使膜浸没在DMSO中，振荡10 min，使甲臜充分溶解。取出小室，将DMSO移到96孔板中，每孔100 μL，于酶标仪上490 nm处读取OD值，按照以下公式计算侵袭率。侵袭率=(测定组OD值－空白对照组OD值)/(迁移组OD值－空白对照组OD值)×100%。

1.2.4 cripto基因蛋白检测 采用免疫荧光法。将胃癌细胞接种到预先放置盖玻片的培养皿中，细胞和盖玻片表面完全吸附后，用PBS洗2次，丙酮固定。PBS振洗后吹干。滴加 cripto单克隆抗体(1∶2 000)覆盖整个切片，4℃过夜。PBS振洗3次后吹干。滴加1∶50稀释的FITC标记的二抗，37℃保温30 min。PBS振洗2次后用蒸馏水振洗。50%缓冲甘油封片。在荧光显微镜下观察，拍照，荧光强度扫描。

1.3 统计学方法 采用SPSS11.5统计软件包进行统计学处理，计量数据以±s表示。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 细胞迁移能力 对照组及实验组不同浓度(20、40、80 μmol/L)细胞迁移距离分别为(420 ±15)、(278±12)、(189±11)、(112±8)μm，细胞迁移距离呈浓度依赖性减少(P均＜0.001)。

2.2 细胞侵袭能力 对照组及实验组不同浓度(20、40、80 μmol/L) 细胞穿过滤膜的细胞分别为(38.6 ±1.5)、(28.2 ±1.8)、(15.8 ±1.2)、(7.8 ±1.6)个，穿膜细胞数呈浓度依赖性减少(P均 ＜0.001)。

2.3 cripto蛋白表达 对照组及实验组不同浓度(20、40、80 μmol/L)细胞 cripto 蛋白表达量分别为(51.86 ±3.36) ×102、(28.56 ±2.25) ×102、(15.36±3.22) ×102、(8.39 ±2.58) ×102pg，cripto 蛋白表达呈浓度依赖性减少(P均＜0.05)。

3 讨论

已证实，EGCG对许多肿瘤细胞生长具有一定的抑制作用［1～6］。研究发现，EGCG 可明显抑制胃癌细胞生长增殖，其机制主要与诱导细胞凋亡有关［7，8］。但目前EGCG对胃癌细胞迁移侵袭的研究甚少。

迁移性是转移性癌细胞的重要特征之一，在成体组织中大多数正常细胞不具有迁移性，活跃迁移的正常细胞主要是中性粒细胞、巨噬细胞和小肠黏膜上皮细胞等。而恶性肿瘤细胞一般具有十分活跃的迁移性。体外培养时，正常细胞具有迁移的接触抑制，因而呈单层生长;而癌细胞丧失了迁移的接触抑制，从而呈多层重叠生长。本研究发现，胃癌BGC823细胞具有较强的迁移性，而经EGCG处理后，细胞迁移能力明显减弱，且呈剂量依赖性，提示EGCG可以有效地抑制胃癌细胞迁移。

肿瘤细胞侵袭转移是一个复杂的过程。一旦肿瘤细胞从原发肿瘤上脱落，将侵入宿主的细胞外基质，然后穿透淋巴管和血管，进行远处转移。在此过程中，肿瘤细胞侵袭细胞外基质是重要的步骤。本研究所用Transwell方法检测癌细胞侵袭中所用的基质胶含有Ⅳ型胶原、层粘连蛋白、巢蛋白、硫酸肝素蛋白多糖等成分，与细胞外基质成分非常相近。因此，能有效地在体外模拟肿瘤细胞的侵袭过程。本研究实验组细胞侵袭呈浓度依赖性减少，提示EGCG可明显抑制胃癌细胞的侵袭能力，从而抑制癌细胞的转移。

cripto基因是表皮生长因子重要成员之一，定位在人类染色体 3p21.3［9］，编码 cripto 蛋白，又称cripto基因。研究发现，cripto基因在许多实体瘤中过度表达，而正常组织表达极低或不表达［10～14］。前期采用免疫组化方法检测大肠癌相关组织，发现cripto基因蛋白过表达与大肠癌细胞浆膜侵袭、淋巴结转移和Duke分期密切相关，而与大肠癌分化程度无关［13］。提示cripto基因与大肠癌细胞侵袭转移密切相关。本文结果发现，实验组癌细胞cripto蛋白表达呈浓度依赖性减少，提示cripto基因参与调控EGCG抑制胃癌细胞侵袭能力。

总之，EGCG可明显抑制胃癌细胞体外恶性迁移和侵袭能力，其机制可能与下调cripto基因表达有关。

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