甲醛固定的H22细胞联合IL-2抑制小鼠H22肝癌生长效果观察

钟秋明，刘 瑶，曾小斌

(赣南医学院第一附属医院，江西赣州341000)

T细胞介导的细胞免疫应答在机体抗肿瘤免疫中起着关键作用，T细胞的致敏、激活和扩增依赖于抗原呈递细胞(APC)提呈相应的抗原多肽并提供共刺激信号［1］。然而，由于许多肿瘤细胞为弱免疫原性，呈现MHC分子与共刺激分子的表达低下或缺如，致使肿瘤抗原不能得到有效的提呈，因而不能激活体内特异性的杀伤机制及诱导机体有效的抗肿瘤免疫应答［2，3］。肿瘤细胞经甲醛固定后其抗原性和免疫原性得以保留，但致癌性大为减弱［4～9］，将其注入肿瘤细胞可有效诱导T细胞介导的细胞免疫。IL-2是体内功能最强的淋巴细胞增殖因子，是有效的抗肿瘤细胞因子［1］。2011年3月～2012年5月，我们建立了小鼠H22细胞皮下移植瘤模型，并联用IL-2和甲醛固定的H22细胞对其进行免疫治疗，效果满意。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组及模型的建立 雌性昆明种小鼠20只，体质量15～20 g，4～6周龄，购自赣南医学院。每只小鼠股部皮下接种1×105个H22肝癌细胞，待肿瘤平均直径达1 cm为模型建立成功。本组20只小鼠均成功造模。随机分为A、B、C、D组，各5只。

1.2 主要试剂及材料 小鼠H22肝癌细胞由赣南医学院第一附属医院临床科研中心保存，小鼠腹腔传代。RPMI1640培养液购自Sigma公司，胎牛血清购自杭州四季清生物工程材料研究所。四甲基偶氮唑盐(MTT)为Amresco公司产品。重组人白介素-2 (rhIL-2)购自厦门特宝生物工程有限公司。兔抗鼠CD8购自eBioscience公司。链霉素—卵白素—生物素—过氧化物酶复合物(SABC)试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。1.3 甲醛固定H22肿瘤细胞 取对数生长期的H22细胞以10%甲醛固定2 h，并分别用70%乙醇和磷酸盐缓冲液洗涤离心两次，转速为1 000 r/ min。弃上清沉淀用RPMI1640重悬后，放置于细胞培养箱内以除去残余的甲醛。48 h后离心，弃上清沉淀用PBS重悬并调整细胞浓度至106/mL，储存于无菌 EP管内备用［6］。rhIL-2工作浓度为8×103IU/mL，放于－20℃保存备用。

1.4 给药及效果观察方法 A、B、C、D组小鼠瘤内分别注射生理盐水0.5 mL、固定H22细胞1×103个(0.5 mL)、IL-2 4×103IU(0.5 mL)、上述量的固定H22细胞和IL-2(共0.5 mL)。rhIL-2浓度为8× 103IU/mL。3 d后重复注射，共注射4次。隔天用游标卡尺测量肿瘤的长、短径。肿瘤体积按公式V (mm3)=0.4ab2计算，a代表长径(mm)，b代表短径(mm)。治疗结束处死动物，取瘤称重，并计算抑瘤率抑瘤率计算公式为［1－(治疗组开始平均瘤体积－治疗组结束平均瘤体积)/对照组开始平均瘤体积］×100%。以40 g/L甲醛固定瘤组织，常规石蜡包埋，切片，采用免疫组化SABC法染色，光镜下观察瘤内T淋巴细胞表达情况。

1.5 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。计量数据用±s表示，组间比较采用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

A、B、C、D组腹部移植肿瘤治疗后质量分别为(6.683±1.102)、(2.851±0.223)、(2.282± 0.443)、(1.052±0.225)g，B、C、D组与A组相比明显降低，D组与 B、C组相比明显降低(P均 ＜0.05)。B、C、D组抑瘤率分别为51.58%、60.54%、80.96%。D组小鼠瘤体内大量肿瘤细胞变性和坏死，且瘤内有大量T淋巴细胞浸润，阳性产物主要呈现在细胞膜上并被染成棕褐色。B、C组瘤内T淋巴细胞浸润数量明显少于D组，A组瘤内未见T淋巴细胞浸润。

3 讨论

肝细胞癌作为一种常见的恶性肿瘤，其发生发展与肝癌细胞抗原提呈功能低下有很大关系［10～12］。目前已有多种方法经动物试验证实可以打破抗肿瘤免疫缺陷，增强抗原提呈细胞的活性，激发T细胞介导的免疫应答达到预防肿瘤生成的目的，但由于安全性和伦理原因未能大规模应用于临床［13］。

如何发现更多的肿瘤特异性抗原及有效的提呈该抗原是激活体内抗肿瘤免疫的关键所在。树突细胞(DCs)是体内最主要的抗原提呈细胞［13］。有学者对部分HCC患者外周血进行分析，发现患者体内DC多伴有成熟障碍及功能受损，不能有效提呈抗原激活免疫［10，11］。体外试验表明用各种方法制备的肿瘤抗原致敏的DC疫苗有引发自身免疫性疾病的可能，其安全性限制了以DC为主的肿瘤免疫疗法在临床工作中的应用。

肿瘤细胞经甲醛固定后其抗原性和免疫原性得以保留，但致癌性大为减弱［4～9］，将其注入肿瘤细胞可有效诱导T细胞介导的细胞免疫。固定的肿瘤细胞能提供特异性颗粒性抗原［4，6］。抗原呈递细胞，尤其是未成熟DC吞噬颗粒性抗原后将特异性肿瘤抗原递呈到MHC I分子，从而激发MHC I限制性CTL反应，特异性杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤生长。

IL-2是体内功能最强的淋巴细胞增殖因子，它能作用于T细胞、大颗粒淋巴细胞、单核细胞和B细胞，进细胞增殖和分泌细胞因子，增强CTL细胞毒活性、促进细胞移动，增强细胞间接触和诱导细胞分泌细胞因子(IFN2α、IL-2、TNF和CSF等)。考虑全身给予重组IL-2会导致较多的全身反应，本研究采取瘤内直接注射的方法，既能提高局部药物浓度，又能避免引起不良反应。

本研究结果证实了甲醛固定H22细胞联合IL-2能显著激活机体免疫系统，明显抑制小鼠皮下移植H22瘤的生长。但人体体外实验的结果并不令人满意:①提取肿瘤抗原需大量癌组织，限制了其临床应用;②肿瘤细胞或其粗提取物及凋亡小体纯度不高，含有自身抗原和其它外源性抗原成份，干扰免疫反应，还可引起免疫耐受或自身免疫性疾病等。尽管目前肿瘤疫苗种类多样，基本点还是建立在增强疫苗原性，最大限度地提高机体主动免疫功能，从而达到杀伤肿瘤细胞目的。虽然应用DC肿瘤疫苗对肝癌患者进行免疫治疗刚刚起步，可以预见肝癌疫苗在不远的将来能成为肝癌治疗的重要手段之一。

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