脑卒中新的生物标志物研究进展

王继贵

(中南大学湘雅二医院检验科，湖南 长沙 410011)

脑卒中新的生物标志物研究进展

王继贵

(中南大学湘雅二医院检验科，湖南 长沙 410011)

本综述阐述了多种用于脑卒中危险预测和诊断的新生物标志物，包括脂蛋白有关的磷脂酶A2、不对称的二甲基精氨酸、基质金属蛋白酶-9、S-100β、N-甲基-D-天门冬氨酸、神经胶质纤维酸性蛋白、二磷酸核苷酸激酶A等的临床意义，及多标志物组合的意义。

脑卒中；生物标志物；诊断

欧美国家中，脑卒中的发病率和死亡率位列第三位，仅次于缺血性心脏病和癌症。全球约有5000万以上的脑卒中及瞬时缺血性发作(TIA)的幸存者，在随后的5年中，五分之一随后将复发脑卒中[1]。脑卒中影响生活质量，有的甚至丧失劳动能力，对家庭、财政及医疗保健都产生巨大的负担。

目前，脑卒中的诊断有赖于医师的临床检查，并依赖影像学技术(CT或MRI)进一步地证实。近十多年来。脑卒中生物标志物的研究有很大进展，单一或多种血液生物标志物在急诊环境中，对于脑卒中的诊断、分型或甚至预测初始/复发脑卒中是有价值的。本文主要介绍近十年来发展的脑卒中新标志物研究概况。

1 理想的脑卒中生物标志物应具备的条件

理想的脑卒中生物标志物应具备：(1)敏感度高，特异性好；(2)能鉴别缺血性脑卒中和出血性脑卒中；(3)梗塞后能早期且稳定的释放；(4)能对危险因素评价和指导治疗；(5)可迅速定量测定且价廉；(6)可帮助急诊医生诊断和评估脑卒中，改善病人的预后。

2 用于脑卒中危险性预测和诊断的新生物标志物

以下介绍几种在脑卒中生物标志物研究领域十分活跃的标志物。

2.1 脂蛋白有关的磷脂酶A2脂蛋白有关的磷脂酶 A2(Lipoprotein associated phospholipase A2，LPPLA2)是一种分子量为50kD的不依赖钙的丝氨酸脂酶，它水解氧化磷脂，释放炎症前溶血卵磷脂和氧化脂肪酸[2]。LP-PLA2在富有巨噬细胞的动脉粥样硬化损害处产生和表达，在进行性冠状动脉损害时显著上调。2005年美国FDA已批准用LPPLA2血液试验评价冠心病和脑卒中的危险因素，在发生脑卒中时它的产生约增加两倍[3]。Ballantyne等[4]研究了12762例表面健康的中年男女，测定了LP-PLA2、CRP及传统的脂质水平，评价了它们同缺血性脑卒中的关系。在追踪观察6年期间，鉴别出194例缺血性脑卒中，在脑卒中和对照组之间，血浆LP-PLA2平均水平具有显著差别(分别为443和 374μg/L，P＜0.001)，而 LDL-C 水平却无差别。 此研究中，在鉴别脑卒中危险因素时，LP-PLA2和CRP浓度是互补的。LP-PLA2水平在三分位数最高组(≥422μg/L)及 CRP＞3mg/L 的个体对缺血性脑卒中具有最高的危险性，比LP-PLA2在三分位数最低组(＜310μg/L)和 CRP＜1mg/L 的个体危险性大11倍。

目前，测定LP-PLA2的方法有活性和质量两个测定法，但它们之间的关联性很差，可能与活性测定所用的基质不同有关。无论是活性或质量试验，关键问题是检测的标准化。

2.2 非对称性二甲基精氨酸 甲基精氨酸的合成是通过L-精氨酸翻译后甲基化，在蛋白水解后以游离的二甲基精氨酸释放。非对称性二甲基精氨酸(Asymmetric dimethylarginine,ADMA)和对称的二甲基精氨酸 (Symmetric dimethylarginine,SDMA)在血液、尿和CSF中均可检出，而SDMA是无活性的。ADMA是一种有效的一氧化氮合酶的抑制剂[5]，它介导广泛的内皮细胞机能紊乱。因此，血浆ADMA增加，被认为是脑卒中危险性预测的一个标志物。Yoo等[6]研究了52例缺血性脑卒中和36例健康对照，用高效液层析串联的质谱 (LC-MS/MS)定量测定了血浆ADMA浓度。结果显示缺血性脑卒中病人组血浆ADMA浓度显著高于对照组(1.85±1.32μmol/L 对 0.93±0.32μmol/L，P=0.0001)。复发性脑卒中平均值为2.28μmol/L，初始脑卒中为1.46μmol/L，对照组为 0.93μmol/L，三组之间 ADMA浓度有显著差别，P=0.0001。

ADMA是一个新的生物标志物，同心血管总的死亡率、内皮功能紊乱和脑卒中的危险性有关，应进一步研究它在临床应用中的有效性。

2.3 基质金属蛋白酶-9基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloproteinases-9,MMP-9)属锌和钙依赖的内肽酶家族，与细胞外基质蛋白周转和降解有关。在组织重建、炎症、血管再生和肿瘤细胞转移中，MMPs起着重要的作用。脑组织MMP-9的表达，通常不可检出，但是在脑缺血时发现MMP-9增加，脑卒中发作后，未控制MMP的表达及活力，介导蛋白质的水解，导致血脑屏障漏出和细胞死亡[7]。在缺血性和出血性脑卒中的病人中，血清MMP-9水平比对照组显著增加，它也同梗塞范围、不良的神经病学后果以及出血变化并发症有关[8]。Ning等[9]证实在用组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)治疗的脑卒中病人中，血浆MMP-9浓度比未治疗的病人显著增高。共研究了52例缺血性脑卒中病人(其中26例用tPA治疗，26例未治疗)，27例为非脑卒中的对照。结果显示：在tPA治疗组，血浆MMP-9中位数为43ng/ml，未治疗组为28 ng/ml，P=0.01。在给予tPA治疗后，血浆MMP-9浓度可作为预测进一步出血并发症的一个指征。MMP-9在脑卒中发病机理中可介导双重作用，一是血脑屏障的瓦解、神经细胞死亡及脑卒中后出血；二是在组织修复期脑再生和神经血管重建期间的愈合作用。MMPs是一个有价值的生物标志物，脑卒中时它同MRI和神经病学预后呈明显相关。

2.4 S100β蛋白 S100β亦称S100B，是一种低分子量的神经胶质蛋白，它属于多基因家族钙介导的蛋白质。S100是指它们在100%的硫酸铵溶液中仍能溶解，亚单位(α和β)的各种联合，构成S100蛋白质家族，它分为杂化型(α-β)及同型(α-α、β-β)二聚体。S100B包含有β-β及 α-β型，发现在脑星形胶质细胞、周围Schwann细胞以及神经元外的黑素细胞、脂肪细胞和软骨细胞中均含有大量的S100B。这个生物标志物不受溶血的影响，且异常稳定[10]。几项研究[11，12]已证实在急性缺血性脑卒中血清S100B浓度显著增加，在症状发作后S100B分泌增加达24h，峰浓度发生在脑梗塞后前24h内。S100B与脑卒中临床严重性和梗塞区大小显著相关，可以作为一个监测参数。血中S100B增加对脑梗塞不是特异的，因为在其他神经病理情况时亦出现增加，包括脑外伤及颅外恶性肿瘤。

2.5 N-甲基-D-天门冬氨酸受体肽及抗体 N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid,NMDA)受体典型地含4个亚单位，2个NR1和2个NR2亚单位，若NR2降解为NR2A和NR2B肽，考虑有脑缺血或神经毒性发生。NMDA受体抗体(NR2Abs)的产生，由缺血事件发生后的免疫系统介导，产生抗脑特异抗原的自身抗体，无论是这些自身抗体或NR2肽碎片本身，在CSF和血中都能定量。

Dambinova等[13]在105例脑卒中和瞬时缺血发作(TIA)病人[其中急性缺血性脑卒中(IS)31例，TIA56例，脑内出血(ICH)18例]及255例对照中用ELISA法测定了抗-NR2A/2B自身抗体水平，以评价它对TIA、IS和ICH的鉴别能力。结果显示：TIA和IS病人组NR2A/2B抗体水平显著升高，与对照比较P＜0.0001；但是不能用抗体浓度区分IS与TIA。在ICH病人组及对照组中，NR2Abs不增加，提示NR2Abs阴性结果不排除ICH。在症状发作3h内，用界值≥2.0μg/L时，对IS或TIA的诊断敏感度为97%，特异性98%，对IS阳性预测值为86%，TIA为 91%，阴性预测值 IS和 TIA均为98%。在急诊环境中，NR2Abs水平对于帮助急性IS的诊断是有用的。Bokesch等[14]在557例经受心脑手术的病人中，评价了NR2Ab浓度预测不利的神经病并发症的能力，其中仅25例病人术前NR2Ab浓度≥2.0ng/ml，但是这25例病人中有24例在术后48h内进展发生了神经病学并发症，相对危险因素RR为17.9，95%CI 11.6～27.6。因此，在高危个体中，NR2Ab对于预测神经病学事件可能是有用的。

2.6 神经胶质原纤维酸性蛋白 神经胶质原纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein，GFAP)是一种单体丝状蛋白，对脑星形胶质细胞是特异的，作为细胞支架蛋白家族，GFAP在调节星形胶质细胞运动和形状方面起着重要的作用。在高等脊椎动物的中枢神经系统中，由于外伤、疾病、遗传病或化学侵蚀，星形胶质细胞以典型的方式作出反应，产生胶质细胞增生，迅速合成GFAP[15]。Foerch等[16]研究了在症状发作后6h内住院的脑卒中病人，根据CT或MRI诊断ICH42例，IS93例，住院后立即采血用自动酶免疫试验检测GFAP。结果显示：ICH病人组有34例检出GFAP(占81%)，中位数11ng/L，IS病人组仅有 5例(占 5%)检出 GFAP，中位数0ng/L，P＜0.001。在界值为2.9 ng/L时，用于鉴别ICH和IS，GFAP的诊断敏感度为79%，特异性为98%，P＜0.001。在脑卒中急性期，GFAP能可靠地鉴别ICH。Dvorak等[17]的研究证实：在脑卒中发作后2～6h之间的时间窗检测GFAP，能最好地鉴别ICH和IS，＜2h检测ICH的敏感度是很低的。Unden等[18]在97例脑卒中病人中，评价了S100B、神经元烯醇化酶(NSE)、GFAP及活化蛋白C-蛋白C抑制剂复合物 (APC-PCI)鉴别ICH和IS的能力，证实GFAP有显著的能力鉴别 ICH和 IS，P=0.005；而S100B(P=0.13)、NSE(P=0.67)及 APC-PCI(P=0.84)则否。而联合GFAP和APC-PCI，能迅速地排除ICH，且在神经影像检查之前，能较早地启动tPA治疗。

2.7 PARK7 PARK7也称之为DJ-1基因，开始是作为一种致癌基因发现的，它编码一种普遍存在的高度保守的蛋白质，后来被认识是常染色体隐性基因，同帕金森(Parkinson)病有关[19]。DJ-1蛋白质的功能仍不清楚，但是有证据提示，它参与氧化应激反应，DJ-1功能丧失导致神经退行性变，阐明DJ-1蛋白的生理作用，有助于了解脑神经元维持神经退行性变的机制及帕金森病的发病机理。Lescuyer等[20]用蛋白质组学技术自一组死后病人的CSF蛋白中鉴定出PARK7，与死前CSF比较，显著增加，随后Allard等[21]用ELISA法测定了622例脑卒中病人和165例正常对照组血浆中PARK7水平，证实在脑卒中发作后30min至3h内，PARK7水平显著增加。与对照比较P＜0.001。用PARK7界值14.1μg/L时，对脑卒中的诊断敏感度为54%，特异性90%，PARK7增加不能准确地区分脑卒中的类型(IS、ICH及TIA)。因此，若测定结果增加，没有进一步的影像学检查，不能启动tPA治疗。

2.8 二磷酸核苷激酶A 二磷酸核苷激酶A(Nucleoside diphosphate kinase A,NDKA)，此酶负责催化各种核苷二磷酸之间磷酸盐的交换，NDKA在各种神经元中表达，被认为是脑卒中后涉及在缺血瀑布中，NDKA同PARK7一起被鉴定和研究[20]。由相同的研究组[21]用ELISA法研究了血浆NDKA水平，在脑卒中症状发作后其浓度增加稍早，诊断敏感度为67%，特异性为90%，有望在多标志物组合板中，参与脑卒中的诊断应用。

3 多标志物组合板的作用

为了改善单个生物标志物对脑卒中诊断的敏感度和特异性，发展了多标志物组合板，它对临床诊断可提供额外的信息，且可迅速得到结果，所需仪器容易使用，且价格可取。除上述介绍的生物标志物外，还可与以前报导过的试验组合，这些试验对脑卒中诊断特异性较低，但联合使用后，在脑卒中诊断、预后或将来的治疗中可能起一些作用。以前用过的一些标志物，大致有以下几种[22]：(1)炎症标志物，属先天免疫反应的一部份，如：CRP、血管细胞黏附分子 (VCAM-1)和单核细胞趋化蛋白(MCP-1)。(2)血脂异常/内皮损伤标志物，如：ApoC1、ApoC3、脑钠尿肽 (BNP)脂肪酸结合蛋白(FABP)。(3)生长因子标志物：来自脑的神经营养因子(BDNF)。(4)内皮损伤标志物：髓磷脂碱性蛋白(MBP)、神经元烯醇化酶(NSE)。 (5)血凝/纤溶标志物：D-二聚体、von Willebrand因子。此外，还有脂联素[23]和同型半胱氨酸[24]也有报告用于脑卒中的临床评价。

Reynolds等[25]用一种多标志物组合板，其中包含 有 S100B、BDNF、von Willebrand 因子 、MMP-9及MCP-1五个标志物，研究了223例脑卒中病人(其中82例诊断为急性缺血性脑卒中)，214例健康对照，自症状发作后6h内采集血液样本。结果揭示：联合上述5个标志物，对急性缺血性脑卒中的诊断敏感度为92%，特异性为93%。这种多标志物组合板，在急诊环境中，用于诊断急性缺血性脑卒中，对于CT扫描可以提供有效的辅助。Lynch等[26]报告用一种26个标志物的组合板研究了65例疑有缺血性脑卒中的病人，157例健康对照。结果用单变量对数分析揭示有4个标志物同脑卒中高度相关，P＜0.001。 当将 S100B、MMP-9、VCAM-1 及von Willebrand因子联合使用时，对缺血性脑卒中的诊断敏感度和特异性均为90%，认为这种以血液为基础的生化标志物，在鉴别急性脑缺血性脑卒中时可能是有用的。

4 展望

上面讨论了几种新的生物标志物，以及多标志物组合板，在脑卒中诊断、危险性分层及预后中的作用。那些敏感度高、特异性好的生物标志物有希望逐渐引进到临床试验室，以提高临床诊断效力。当前的主要问题，除继续研究发现新的理想的脑卒中生物标志物外，对于已研究过的有效标志物，应发展成POCT试验(Point-of-care testing，床旁试验)，使在急诊环境中，能在30～60min内得出检验结果，这样可大大改善病人的诊疗效果。在发展POCT试验的过程中，应注意检测的标准化，使不同厂商的产品具有可比性，避免对临床诊疗工作带来混乱。

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Progress of research for new biomarkers in stroke

WANG Jigui.The Second Xiangya Hospital of Central South University，Changsha 410011,China

This review elaborates on new biomarkers for risk prediction and diagnosis of stroke including lipoprotein associated phospholipase A2,asymmetric dimethylarginine,matrix metalloproteinases-9,S-100β,N-methyl-D-aspartic,glial fibrillary acidic protein and neucleoside diphosphate kinase A.It also elucidates roles of multimarker panels.There is a clear need for further development and translational research in this area.

Stroke;Biomarkers;Diagnosis

R743.32

A

1674-1129(2012)04-0323-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2012.04.001

王继贵，男，1937年9月出生，原湘雅二医院检验科主任，主任检验师，临床生化专业