反相高效液相色谱法测定大鼠脑组织中4种氨基酸类神经递质

张宇浩 马昱 郭曦 王勤 曹志娟

（1.复旦大学附属中山医院神经内科，上海 200032；2.复旦大学附属中山医院分部内科，上海 200052；3.空军94789部队机关医院口腔科，江苏南京 210018；4.复旦大学药学院，上海 200032）

存在于脑组织和脑脊液中的多种氨基酸类神经递质，对于调节机体生理活动具有重要作用，其含量及比例的变化伴随着多种中枢神经系统疾病的发生及发展［1］。其中，谷氨酸（glutamate，Glu）和天门冬氨酸（aspartate，Asp）是脑部的兴奋性神经递质，牛磺酸（taurine，Tau）是脑部的抑制性神经递质，γ－氨基丁酸（γ－aminobutyric acid，γ－GABA）的作用较为复杂。测定神经递质含量的变化对于神经系统疾病的诊断、治疗和预后分析有重要的参考价值。常用的氨基酸类神经递质的测定方法为高效液相色谱法、微流控、电泳法分离与衍生化后荧光检测相结合［2－3］。通常采用丹酰氯衍生化、邻苯二甲醛（O－phthalaldehyde，OPA）、2，4－二硝基氟苯、2，6－二甲基－4－喹啉羧酸－N－羟基琥珀酰亚胺酯［4］等试剂进行柱前衍生荧光检测氨基酸的含量［4］。其中，OPA检测的灵敏度高，衍生化反应迅速安全。本研究对大鼠脑组织中的神经递质的测定，采用OPA作为柱前衍生化试剂，建立一种简单、快速、灵敏的高效液相色谱技术，以期为神经系统疾病发病机制的研究提供方法基础。

1 资料与方法

1.1 试剂和仪器 Asp、Glu、γ－GABA、Tau和OPA（纯度80%）购自于上海日初生化有限公司；高丝氨酸（homoserine，Hse）和β－巯基乙醇购自于Sigma公司。乙腈和甲醇购于汉邦试剂有限公司，均为一级色谱纯。高氯酸、磷酸二氢钾、碳酸钾等试剂均购自于国药试剂集团，分析纯。超纯水由Millipore公司生产的Milli－Q纯水仪制备。

液相色谱仪系统：HITACHI L2000型高效液相色谱仪，包括 Hitachi Organizer（试剂架），L－2130型四元泵、L－2200型自动进样器，L－2300型柱温箱，L－2455型二极管阵列检测器，L－2485型荧光检测器，日立色谱工作站，由日本日立公司提供。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱为Dikma Inertsil ODS（250mm× 4.6mm，3.5μm），预柱 Dikma，C18，4.0mm×3.0mm。流动相为磷酸二氢钾缓冲液（0.1mol／L，pH 6.0）∶甲醇∶乙腈 （6∶3∶1）；流速为1mL／min；检测条件：荧光检测器，激发波长为345nm，发射波长为460nm。柱温40℃，进样量20μL。

1.2.2 试剂配制

1.2.2.1 衍生化试剂的配制及衍生反应 称取13.4mg的OPA溶于1mL的乙醇中，加入20μL β－巯基乙醇以及4mL四硼酸钠缓冲液（0.1mol／L，pH 9.6）。密封后低温保存。隔天加入20μLβ－巯基乙醇。标准溶液和预处理后样品精密量取40 μL，加入OPA衍生剂20μL轻轻混匀，静置2min，进样20μL进行高效液相色谱分析。以保留时间定性，峰面积内标法定量。

1.2.2.2 储备液的配制 精密称定 Asp 13.10 mg、Glu 14.71mg、γ－GABA 10.31mg 和 Tau 12.53mg，分别置10mL容量瓶中，加入含50%甲醇的0.1mol／L碳酸钾溶液（Buffer A）定容，制得浓度为10mmol／L的各种氨基酸母液。精密称取Hse 119.12mg置100mL量瓶中，加入Buffer A溶解，定容制得10mmol／L的内标母液。精密吸取Asp、Glu、γ－GABA和Tau母液各1.0mL，分别置10mL量瓶中，Buffer A稀释定容，作为1号储备液（1mmol／L）；再次精密吸取1mL各氨基酸的1号储备液，分别置10mL量瓶中，Buffer A定容作为2号储备液（100μmol／L），－20℃保存。提取回收率储备液配制：精密吸取10mmol／L的 Asp、Glu、γ－GABA和Tau母液0.3mL置于同10mL量瓶中，Buffer A稀释定容即得3号混合标准储备液（0.3 mmol／L）。

精密量取3mL的内标母液置100mL的量瓶中，Buffer A稀释定容可得1号内标储备液（0.3 mmol／L）；精密量取1mL的内标母液，置10mL的量瓶中，Buffer A稀释定容可得2号内标储备液（1mmol／L）；精密量取2号内标储备液1mL，置100mL容量瓶中，用Buffer A稀释定容得3号内标储备液（10μmol／L）。

1.2.3 标准曲线的绘制 分别精密量取Asp、Glu、γ－GABA、Tau的2号储备液各1.0mL置同一个10mL量瓶中，用Buffer A稀释定容，作为1号工作液（10μmol／L）。随后，精密取1号工作液0.1 mL、0.2mL、0.5mL、1mL、2mL和3号内标储备液1mL置同一个10mL量瓶中，用Buffer A稀释定容，作为2、3、4、5、6号工作溶液，浓度依次为0.1 μmol／L、0.2μmol／L、0.5μmol／L、1μmol／L、2 μmol／L的混合标准品溶液，其中内标液浓度均为1 μmol／L。按以上实验条件进样，每次进样20μL，测定混合标准氨基酸中各组分的峰面积，计算其与内标峰面积的比值，并拟合标准曲线回归方程。

1.2.4 精密度和准确度测定 配制浓度为0.5 μmol／L氨基酸混合标准品溶液5管，按标准曲线制备的方法处理，衍生后进样测定，计算日内精密度和回收率；以相同方法配制相同浓度的标准品5份，连续3d，按上述方法进行测定，计算日间精密度和回收率。

1.2.5 提取回收率 取0.4mL人工脑脊液（配置方法：每100mL蒸馏水含NaCl 730mg，KCl 10 mg，NaH2PO4·H2O 12.5mg，Na2HPO4·12H2O 71mg，MgCl2·6H2O 20mg，CaCl218mg，D－葡萄糖90mg，pH 7.3～7.5），加入50μL的3号混合标准储备液（0.3mmol／L）和50μL的3号内标储备液（0.3mmol／L），再加入1mL 的 HClO4（0.4 mol／L）去蛋白，混匀后，4℃条件下，3 000r／min低温离心15min，取上清液0.5mL，加入2mol／L K2CO3溶液1mL，再加入0.1mol／L K2CO3稀释至5mL，4℃条件下，14 000r／min低温离心20 min，取上清，4℃保存，衍生后，分别取20μL进样，计算提取回收率的4种氨基酸的浓度CX（μmol／L）。按下列公式计算提取回收率。回收率（%）＝30 000CX／C0×100%，其中C0为3号混合标准储备液的浓度（0.3mmol／L）。

1.2.6 脑组织样品预处理 SD大鼠（中国科学院上海生命科学研究院实验动物中心提供）1只，体质量248g，快速断头取脑，放在冰盘上分离脑组织，留取海马组织，精密称质量后，加入0.8mL人工脑脊液，手动玻璃匀浆器冰浴匀浆，4℃条件下，3 000r／min低温离心15min，取上清液0.4mL，加入50 μL的3号混合标准储备液（0.3mmol／L）和50μL的3号内标储备液（0.3mmol／L）和1mL的HClO4（0.4mol／L）去蛋白，混匀后，4℃条件下，3 000r／min低温离心15min，取上清液0.5mL，加入2mol／L K2CO3溶液1mL，再加入0.1mol／L K2CO3稀释至5mL，4℃条件下，14 000r／min低温离心20min，取上清液，4℃保存，用前衍生后进样。

2 结 果

2.1 4种氨基酸的分离 4种氨基酸类神经递质在15min内均得以很好的分离，其保留时间分别为：Asp 3.60min，Glu 3.89min，Hse 7.45min，Tau 11.47min，γ－GABA 13.29min。各种氨基酸峰形良好，无重合、双峰、拖尾等现象。样品中的其他杂峰亦可与待测氨基酸完全分离。

2.2 线性范围和相关系数 系列浓度的混合氨基酸标准品（2～6号工作溶液）进行HPLC检测后，各峰面积与浓度间呈现良好线性关系。以各种氨基酸组分浓度（C）为横坐标，相应的峰面积（A）与内标峰面积（A0）的比值为纵坐标，进行回归，其浓度与峰面积呈良好线性关系，得到的回归方程式：y＝ax＋b。其中y为峰面积比值，a为斜率，x为各氨基酸的浓度，b为截距，相关系数r。见表1。

表1 各种氨基酸的标准曲线方程

2.3 精密度和准确度 在所建立的HPLC方法下，测定同一样品中4种氨基酸的精密度，结果显示其重现性较好，高、中、低3个标准溶液连续5次进样，Asp、Glu、Tau和γ－GABA峰面积与内标峰面积比值的日内和日间变异系数分别为0.61%～7.91%、4.78% ～6.26%、10.5% ～16.3% 和 0.27% ～10.98%，回收率分别为90.5%～111.3%、90.8%～101.5%、98.6%～101.9%和95.6%～104.4%。2.4 提取回收率试验 3个空白样品中添加低、中、高3个浓度水平的标准品完成，经过样品预处理方法进行处理后，对比检测量和实际量，多次测定Asp、Glu、Tau 和 γ－GABA 提 取 回 收 率 分 别 为91.1%～112.2%、82.7% ～99.3%、66.8% ～98.8%和86.2%～104.0%。

3 讨 论

本研究采用OPA柱前衍生，建立了一种高效液相－荧光检测技术，方法准确灵敏、重现性好，适合于脑组织样品中各种氨基酸的检测。本研究用的荧光衍生试剂纯度为80%，带入了一些干扰成分，虽然在本研究条件下，干扰成分不影响4种氨基酸的测定，但可考虑在以后的研究中换用更纯的试剂，以降低干扰。由于OPA试剂性质活泼，放置于空气中易氧化，因此在其保存液中加入β－巯基乙醇，对OPA具有保护作用，并将其保存于较低温度也可防止其氧化变质。此外，脑组织样品中也具有多种成分的干扰，本研究中采用60mmol／L磷酸盐浓度作为流动相添加剂，获得了较好的峰形和分离度。从图谱上可以看出，若样品中添加其他的氨基酸如组氨酸（6.12min）、甘氨酸（8.87min）等，其测定将一定程度上受到组织样品的干扰，后续研究将进一步观察流动相组成成分和比例，以期用于更多组分的检测。

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［2］ Sandlin ZD，Shou MS，Shackman JG，et al.Microfluidic electrophoresis chip coupled to microdialysis for in vivo monitoring of amino acid neurotransmitters［J］.Anal Chem，2005，77（23）：7702－7708.

［3］ Cellar NA，Burns ST，Meiners JC，et al.Microfluidic chip for low－flow push－pull perfusion sampling in vivo with on－line analysis of amino acids［J］.Anal Chem，2005，77（21）：7067－7073.

［4］ Huang KJ，Yu S，Li J，et al.Extraction of neurotransmitters from rat brain using graphene as a solid－phase sorbent，and their fluorescent detection by HPLC［J］.Microchim Acta，2012，176（3－4）：327－335.