植物抗寒基因研究进展

刘文英，张永芳，张东旭

（山西大同大学农学与生命科学学院，山西大同 037009）

植物抗寒基因研究进展

刘文英，张永芳，张东旭

（山西大同大学农学与生命科学学院，山西大同 037009）

低温是一种常见的非生物胁迫，是限制植物分布、降低作物产量及品质的重要原因之一，是农业生产中的一种严重的自然灾害。随着植物抗寒分子机理的不断深入研究，目前已经克隆了很多植物抗寒相关基因，可通过基因工程手段提高植物的抗寒性，对农业生产具有重要意义。本文综合概述了目前已克隆的重要植物抗寒基因的最新研究方向、进展及应用。

植物；低温；抗寒性；基因

低温是植物所面临的重要的逆境因子。低温不仅会限制植物的广泛分布，在低温环境下，植物的生长发育会受到严重影响，会引起植物内发生一系列的不良生理代谢反应，直接导致农作物产量和品质明显下降，甚至会引起植株的死亡。全世界每年由于低温造成的农业经济损失可达到数千亿元［1］。植物只能生长在特定的环境中，不能像动物一样通过移动而躲避严寒，而是有自己独特的耐寒机制。克隆重要耐寒基因不仅能更好地了解植物的生长发育分子调控机制，而且可以通过生物工程技术来提高植物的耐寒性，具有重要的理论实践意义。20世纪80年代，由于分子生物技术的引入，克隆了大量抗寒相关基因，通过转基因验证，发现其中部分基因对提高植物的耐寒性起着重要作用［2-3］。

1 冷诱导基因

冷诱导基因（COR基因）是一类在低温下才被诱导或大量表达的基因，这些基因的表达使植株表现出一定的抗寒能力。在适合植物生长的正常温度范围内，COR基因的表达量通常很低甚至不表达，此时植物的抗寒能力仅是一种可开发的潜能。至今，已从拟南芥、大麦、油菜、苜蓿、菠菜等植物中鉴定出大量冷诱导基因大约有上百种［4］，如cor15a，Bn28，cor78/rd29A，cor6.6/kin2，cor47/rd17，wcs120、kin1等，并对这些基因在低温下的表达调控及编码蛋白在抗寒过程中的作用机制等问题进行了研究。

尽管这些COR基因来自于各种不同的植物，却表现出许多相同的特征，COR基因的表达产物，大多具有极强的亲水性，许多还包含一段特殊的区域，能够形成亲水脂性的α-螺旋。目前已经克隆的冷诱导基因都含有一个共同的调控元件，其具体序列为CRT（TGGCCGAC）/DRE（TACCGACAT），作为顺式作用的启动子元素，能在低温胁迫时激活COR基因的表达，使植物不需经过冷驯化就具有抗冻性。COR基因主要由4个基因簇组成，每个基因族又是由2个基因一前一后串联组成。其中COR15，COR78和COR616家族的偶基因能编码新的多肽，而COR47家族的偶基因则编码LEAⅡ类蛋白的类群蛋白［5］。

大多数冷诱导基因除受低温应答外，还对一些其他胁迫也作出应答，如高盐、ABA、干旱、渗透等。对COR基因进行的诱导调控主要在3方面进行，有发生在转录水平上的，有发生在转录后水平的，还有的在转录和转录后两个水平都进行调节。低温可以诱导许多基因的大量表达，目前已经建立了很多植物的低温诱导cDNA文库，包括水稻、拟南芥、大麦、小麦、苜蓿、菠菜等。很多转基因研究表明，导入冷诱导基因能够提高植物抗寒性的能力。目前大多数抗寒基因来自拟南芥等模式作物，仍有很多抗寒基因表达调控机制及编码蛋白质的抗寒机理还需要进一步深入研究。

2 抗寒相关转录因子

植物在遭受低温胁迫时，从感受到低温信号到产生一定的抗寒能力，这个过程中存在一个复杂的信号传导系统，会引发一系列的生理生化反应，使耐寒相关的基因大量表达，这些都受到转录因子的调节。最近，与抗寒性相关的蛋白质转录因子基因克隆及其表达调控已经取得一些进展，它能诱导多个或成组相关抗寒反应基因表达。了解的比较清楚的有CBF调控因子（CRT/DRE-binding factor），可诱导一百多个基因的表达［6-7］。

CBF转录因子是一类受低温诱导的反式作用因子，1997年首次从模式作物拟南芥中分离鉴定出CBF1［8］，这种转录因子具有特异地识别COR基因启动子部分的顺式作用元件CRT/DRE基序，并且结合上去。CBF基因家族又分为几大类，主要包括CBF1，CBF2，CBF3，CBF4，CBF5和CBF6。DNA序列分析表明，CBF家族中的4个成员其基因阅读框架中都不包括内含子序列，其中CBF1，CBF2和CBF3基因编码的蛋白质的氨基酸序列的同源性为88％，相似性高达91％。4种蛋白质中都有相同的结构AP2结构域基序。在常温条件下，植物体内的CBF基因表达量很低甚至为零，在低温条件下，表达量会大量增高。它的信号传导途径是：CBF转录因子→CRT/DRE基序→COR基因表达→植物抗寒性增加，即转录因子CBF作为反式作用因子，首先识别COR基因启动子部分的顺式作用元件CRT/DRE序列，并结合上去，通过调控诱导COR基因的表达量明显升高，从而提高了植物的抗寒性［9］。有研究表明，将外源CBF1基因转入到未经冷驯化的拟南芥中，经检测转基因拟南芥植株中的CBF基因的表达量明显高于野生型植株，即使在常温下也能诱导COR基因的大量表达，而野生型植株的COR基因在常温下表达量很低，增强了拟南芥的抗寒能力。拟南芥CBF3基因的过量表达，导致了一系列与低温胁迫应答相关的各种生理生化变化，也提高了转基因植株的抗寒能力。

3 脂肪酸去饱和酶基因

当植物受到低温胁迫时，细胞膜是受到胁迫伤害的原初位点。在低温条件下，膜脂从液相变成凝胶相，脂膜上的脂肪酸链由无序排列变为有序排列，生物膜的脂类会出现相变和分离，从而引起使酶亚基分解或与膜结合的酶解离，而使酶活性降低甚至丧失。由于膜脂的相变和膜蛋白的解离，使膜上出现了裂痕，使细胞膜的通透性不同程度的增大，胞内溶质外渗，细胞内相应的酶系统和代谢过程遭到破坏，打破离子平衡，引起代谢失调。有研究表明膜的不饱和脂肪酸的不饱和度与含量越高，相变温度就越低，就越有利于维持膜在低温时的流动性，植物的抗寒性就越强。

GPAT是磷酰甘油生物合成过程中的第1个酰基酯化酶，催化酰基由供体向3-磷酸甘油的sn-1位转移，对决定植物膜PG的不饱和度起关键作用。目前在水稻、黄瓜、豌豆、拟南芥等植物中都克隆到了GPAT基因。有研究表明，将外源GPAT基因分别转入拟南芥和烟草中，结果发现转基因植株中脂肪酸组成发生了改变，膜脂不饱和度明显高于野生型植株，提高了植物的抗寒能力［10］。

脂肪酸去饱和酶（FAD）是脂肪酸代谢过程中的关键酶之一，其催化的反应是将一部分饱和脂肪酸生成不饱和脂肪酸，也是不饱和脂肪酸合成途径的关键酶之一。FAD能作用于细胞膜脂能降低细胞膜中饱和脂肪酸的含量，增加不饱和脂肪酸的含量，提高膜脂的不饱和度。在拟南芥、蓖麻、水稻、小麦、大豆等植物中都已克隆到了FAD基因。在模式植物拟南芥中最先克隆得到AtFAD7和AtFAD8基因，它们的核苷酸序列同源性高达75％，并且都与各自的叶绿体中的ω-3去饱和酶基因的功能互补，两者配合起来共同作用，可催化膜脂中脂肪酸的去饱和作用。将外源FAD7基因转到烟草中，进行低温处理，发现提高了转基因烟草中C18：3不饱和脂肪酸的含量，耐寒性也明显增强［11］。近几年，利用基因工程技术将脂肪酸去饱和代谢关键酶基因转入到各种低温敏感植物中，经检测植物细胞膜中脂肪酸的饱和度都有不同程度的降低，增强植物的抗寒性，培育出许多新的抗寒品种，取得了很多突破性的进展。

4 抗冻蛋白基因

当温度降低到零摄氏度以下时，会引起植物细胞外和细胞内都结冰，称为低温冻害。抗冻蛋白（AFP）是一类具有提高生物抗冻能力的蛋白质类化合物的总称，能以非依数的形式降低水溶液的冰点，能够直接与冰晶进行相互作用，从而抑制冰晶的生长。AFP在20世纪60年代从南极和北极动物的血清中先发现的，能与冰晶特异性的结合，维持体内液体的非冰冻状态，当受到零度以下的低温时可使生物抵御冰冻环境。当低温导致结晶生成时，抗冻蛋白变会活化，能特异地吸附于冰晶表面，抑制冰晶的重晶化，阻止晶格的形成，以及阻止小的冰晶结成更大的冰晶，从而减轻冰晶在冻融的动态变化中对生物体的伤害。一旦温度回升，AFP又失去活性。

在许多耐冻的生物体内都发现抗冻蛋白的存在，AFP最早在极地海鱼中发现的，在植物中起步较晚。极地鱼类的抗冻蛋白基因结构中有许多序列重复的多拷贝序列。将比目鱼的AFP基因转入到拟南芥、烟草、马铃薯和油菜等植物中，获得了较好的抗寒效果，结果发现转基因植株的自然结冰平均温度比野生型植株都有明显的下降，平均降低了1.8℃，其中转基因烟草的冰点下降最明显，降低了3～5℃，说明了动物的AFP基因转入到植物中可以提高植物的抗寒能力。1992年，加拿大Griffith首次在冬黑麦中发现了植物AFP蛋白，标志着植物抗冻蛋白研究的开始。

目前，已经在冬小麦、燕麦、冬黑麦、胡萝卜、沙冬青、桃树、甜杨等高等植物中分离到AFP蛋白。这些抗冻蛋白之间的相似性很低，它们的氨基酸组成、相对分子质量和同源性都不相同。抗冻蛋白中主要有7个多肽组分表现出了明显的抗冻活性，其中5种多肽活性较高，且相对分子质量较大分别为16，25，32，34，36kDa。植物的AFP蛋白，可通过冷驯化诱导获得。1998年，从胡萝卜中克隆到了第一个植物AFP基因。AFP基因的表达主要靠温度控制，在正常状态下AFP基因不表达，在冷驯化状态下表达水平特异性的提高，以增加生物对寒冷的适应能力。植物AFP可在冷诱导植物的根茎叶等器官中产生，也可在植物组织培养条件的愈伤组织和悬浮细胞中产生。2000年从冬黑麦的叶片中克隆得到具有几丁质酶活性的抗冻基因。AFP的特点是利用AFP的冰晶重结晶抑制效应，与植物细胞膜相互作用，防止在低温过程中细胞冷冻-解冻过程中得损伤。将胡萝卜的AFP基因导入烟草，发现可以抑制烟草冰晶生长，增强其抗寒性，使植物具有抗冻能力。

植物的抗寒性是有多个基因控制的数量性状，目前已经克隆了一些抗寒基因并通过基因工程技术提高了植物的抗寒性。虽然植物抗寒相关领域已取得了一定的进展，但仍存在一些问题，植物的低温反应和抗寒分子机理不清，研究方法单一，表达系统不完善。目前一些尚未有定论的认识，如COR基因的具体功能及其调控方式如何、相变发生的温度范围、低温信号是如何传递的、各种抗寒基因是怎样表现出抗寒活性的、以及如何将外源抗寒基因转到不耐寒植物中以提高其抗寒性等。今后的研究方向将主要致力于加强抗寒分子机理研究、克隆更多的抗寒相关基因、完善表达系统、丰富研究方法等方面。研究植物抗寒性的目的在于提高农作物的抗寒性，实现通过抗寒基因表达和多种抗寒技术相结合来提高植物抗寒性这一目标。

［1］邓江明.植物抗冻机理研究进展：抗冻基因表达及其功能［J］.植物学通报，2000，18（5）：521-530.

［2］Fowler S，Thomashow M F.Arabidopsis transcriptome profiling indicates that multiple regulatory pathways are activated during cold acclimation in addition to the CBF cold response pathway［J］.Plant Cell，2002，14：1675-1690.

［3］Maruyama K，Sakuma Y，Kasuga M，et al.Identification of cold-inducible downstream genes of the Arabidopsis DREB1A/CBF3 transcriptional factor using two microarray systems［J］.J Plant，2004，38：982-993.

［4］Chinnusamy V，Zhu J H，Zhu J K.Cold stress regulation of gene expression in plants［J］.Trends Plant Sci，2007，12（10），444-451.

［5］Thomashow M F.Arabidopsis thaliana as a model for studying mechanisms of plant cold tolerance［M］.NY：Cold Spring Harbor Laboratory Laboratory Press，1994.

［6］Vogel J T，Zarka D G，Van Buskirk H A，et al.Roles of the CBF2 and ZAT12 transcription factors in configuring the low temperature transcriptome of Arabidopsis［J］.J Plant，2005，41：195-211.

［7］Gilmour S J，Zarka D G，Stockinger E J，et al.Low temperature regulation of the Arabidopsis CBF family of AP2 transcriptional activators as an early step in cold-induced COR gene expression［J］.J Plant，1998，16：433-442.

［8］Stocking E J，Gilmour S J，Thomashow M F.Arabidopsis thaliana CBF1 encodes an AP2 domain-containing transcriptional activator that binds to C-repeat/DRE，a cis-acting DNA regulatory element that stimulates transcription in respones to low temperature and water deficit［J］.Pnas，1997，94：1035-1040.

［9］林茂，闫海霞，眭顺照，等.植物CBF转录因子及其在基因工程中的应用［J］.广西农业科学，2008，39（1）：21-25.

［10］Wolter F P，Schmidt R，Heniz E，et al.Chilling sensivity of Arabidopsis thaliana with genetically engineered membrane liquids［J］.J Eur Mol Biol Organ，1992，11（13）：4685-4692.

［11］Kodama H，Hamada T，Horiguchi G，et al.Genetic enhancement of cold tolerance by expression of a gene for chloroplast ω-3 fatty acid desaturases in transgenic tobacco［J］.Plant Physiology，1994，105（2）：601-605.

〔责任编辑 杨德兵〕

Study on Cold Resistant Genes in Plants

LIU Wen-ying，ZHANG Yong-fang，ZHANG Dong-xu
（School of Agronomy and Life Science，Shanxi Datong University，Datong Shanxi，037009）

Chilling temperature is an important environmental factor affecting plant distribution，yield and quality.It is important to improve the cold resistance of plants.In recent years，lots of plant cold resistant gene have been cloned due to the great advances in the research of molecular mechanisms of cold resistance.The studies of genetic engineering for cold resistance in plants have been carried out extensively.In this paper，recent progresses of plant cold resistant genes are summarized，including new research，application and brought forward.

plant；chilling temperature；cold resistance；gene

S184

A

1674-0874（2012）06-0052-04

2012-09-25

刘文英（1981-），女，山西大同人，博士，讲师，研究方向：植物基因克隆。