油田污水中硫酸盐还原菌检测技术的研究进展

关淑霞,叶海春,范莹莹

(东北石油大学化学化工学院，黑龙江 大庆 163318)

在油田生产过程中，硫酸盐还原菌(Sulphate reducing bacteria，SRB)的大量繁殖造成一系列严重问题：油田注水设备的腐蚀、地下油层被污染、管线堵塞等。据报道，美国由于SRB造成生产井的腐蚀约占77%以上，每年经济损失约120亿～130亿美元[1，2]。为控制SRB的大量繁殖，常采用投加杀菌剂的方法，但随着细菌耐药性的增强，杀菌剂投加量及杀菌费用不断增加。若能及时、准确地检测SRB，则能有效控制杀菌剂投加量。

目前，检测SRB的技术主要有以下几种：传统培养检测技术、显微镜直接检测技术、传感器检测技术、代谢物检测技术、PCR技术、荧光原位杂交技术等。作者在此综述了近年来国内外SRB检测技术的研究新进展，并分析比较各种检测技术的优缺点，拟为选择更为有效的检测方法提供依据，也为进一步完善检测技术指明方向。

1 SRB的生长特性

SRB是指能将亚硫酸盐、硫酸盐、硫代硫酸盐等含硫氧化物及单质硫还原成H2S的细菌的统称；是一类营养类型多样、形态各异、能利用含硫物质或利用其它氧化态硫化物作为电子受体进行异化有机物质的厌氧细菌。SRB的生长繁殖受到很多因素的影响，如温度、pH值、矿化度及聚丙烯酰胺(HPAM)浓度等。山丹等[3]研究了温度、pH值、矿化度及HPAM浓度对SRB优势菌生长的影响，结果表明：油田污水中SRB生长的最佳温度为40 ℃、最佳pH值为8，污水中矿化度在9000 mg·L-1时较合适，HPAM浓度在500 mg·L-1为宜；对SRB生长影响最大的是pH值，HPAM浓度和温度次之，影响最小的是矿化度；当温度高于50 ℃或低于20 ℃、pH值大于9或小于7、 HPAM浓度超过1000 mg·L-1时均可能对SRB有抑制作用。Larry等研究发现，SRB生长环境的Eb必须低于-150 mV。张小里等[4]研究发现：SRB能够耐受氧气浓度为4.5 mg·L-1的环境，但是溶解氧的浓度不能超过9.0 mg·L-1；能够正常生长在NaCl浓度小于0.818%的溶液中，当NaCl浓度在0.972%～2.228%时，SRB只能存活在水下沉积物中，当NaCl浓度大于2.45%时，SRB不能存活；Fe2+含量小于13 mg·L-1时SRB的生长繁殖受到抑制，随着溶液中Fe2+含量的增加，SRB代谢旺盛，生长高峰期延长，高含量的Fe2+对SRB生长繁殖没有抑制作用；但在有氧和无氧环境下SRB生长的适宜pH值不同。

2 SRB的检测技术

2.1 传统培养检测技术

传统培养检测技术是目前油田应用较为广泛的方法。其原理是：将待测污水样用1 mL无菌注射器逐级注射到细菌测试瓶中接种稀释，恒温培养，根据细菌的阳性反应和稀释倍数，计算污水样中细菌的含量。该法的依据是APIRP-38美国石油学会推荐的地下注入水分析方法中的绝迹稀释法。白莉[5]发明了能直接用于测定SRB含量的测试液和测试瓶。

传统培养检测技术主要是用培养基激活SRB，使代谢产物与Fe2+反应生成沉淀，通过观察测试瓶内的阳性反应来确定SRB含量。该方法很大程度上取决于SRB的活性，当样品中SRB含量少但活性高时，发生的细菌阳性反应比较明显，从而导致检测结果偏高；当样品中SRB含量多但活性低时，发生的细菌阳性反应不明显，从而导致检测结果偏低。

传统培养检测技术的优点是：操作简单，成本低；不易染菌，抗干扰性强，结果准确性较高。缺点是：培养时间长(14 d)；检测结果的重现性差；培养菌种不完全导致检测结果偏低。缩短培养时间和完善培养基是该方法有待提高的方面。

2.2 显微镜直接检测技术

Galbraith等[6]用异硫氰酸盐荧光素(FITC)和间接荧光抗体技术(IFA)定量测定细菌总数和SRB的总含量。由于FITC可粘附在细菌的蛋白质上，因此，将经FITC处理过的微生物置于带有荧光的显微镜下放大观察，即可得到细菌的总数，但不能计算出SRB的总含量，从而导致检测结果偏高；因IFA仅只粘附在SRB上，所以在荧光显微镜下能很明显地观察并计算出SRB的总含量。陈蓉等[7]在传统培养检测技术的基础上结合显微镜直接检测技术，开发出了一种快速检测SRB的方法，即将待测水样用1 mL无菌注射器逐级注射到测试瓶中稀释，然后在恒温箱中培养2 d，再用石炭酸—品红染色液进行染色处理，被染色处理后的SRB在生物显微镜下呈现紫红色略带弯曲状，结合绝迹稀释法的计数原理即可计算出SRB的总含量。

显微镜直接检测技术的优点是：培养时间短(约2 d)；操作简单，成本低。缺点是：需要特定染色剂和专业人员操作；对死活细菌不能辨别，检测结果偏高且重现性差。

2.3 现代检测技术

现代检测技术是不依靠培养基激活SRB的生长、繁殖，而是借助现代技术手段直接检测SRB含量的方法。与传统的检测技术相比，现代检测技术检测速度快、检测结果较为准确且重现性好。

2.3.1 传感器检测技术

传感器检测技术的原理[8]：SRB在无氧条件下将硫酸盐中的硫还原成S2-，同时将样品中的有机物氧化，其代谢方程可表示为：

式中：“C”表示有机物；M表示价数为2的金属离子。从方程式可知，可直接用S2-选择性电极和AgCl参比电极测量溶液中的电动势，然后根据电动势计算出S2-的浓度，ASTM的检测方法认为溶液中H2S的浓度大于50×10-6就能检测到SRB的存在。利用该原理，黄彦良等[9]发明了一种SRB测量传感器，能够对SRB含量进行现场检测。

传感器检测技术的优点是：检测速度快，溶液中菌浓度大于50×10-6时，只需2 ～3 d就能检测出细菌含量；无H2S气体产生；便于在线分析；能够清晰地描绘出细菌生长的4个阶段。缺点是：溶液中菌浓度低于50×10-6时，检测不到细菌含量；不利于现场测试。

2.3.2 代谢物检测技术

SRB的代谢活性直接反映了SRB在油田生产中的危害程度，由此研究者们提出通过测定SRB代谢产物H2S的含量来对SRB进行检测。李婉义等[10]建立了TIMB法，此法的原理为：培养液中三碘化亚甲基蓝与维生素C反应生成氧化型亚甲基蓝，使得溶液呈蓝色；在遇到SRB代谢产物S2-时，生成还原型亚甲基蓝，使得溶液变为无色；从而计算出SRB的含量。TIMB法的优点是：操作简单、耗时短、不产生H2S气体。缺点是：三碘化亚甲基蓝与维生素C发生反应，影响检测结果，需严格控制维生素C的用量；对被检测SRB在溶液中的含量有要求；辨别颜色时存在人为误差，检测结果的精确度不是很高。

SRB的胞内含有特定的腺苷-5′-磷酸硫酸盐还原酶(APS)，可催化还原腺苷-5′-磷酸硫酸盐生成还原产物，还原产物与显色剂反应，将反应结果与标准菌量读数卡进行比较，间接计算出样品中的SRB含量(还原产物的含量直接决定显色反应的强弱)。Odom等[11]利用这一原理检测出污水中SRB的含量。美国Conoco公司通过检测SRB中特有APS来直接测定污水样中SRB的含量。样品经超声波破碎处理后，SRB释放出胞内特有APS，APS与检测系统的抗体接触，就能快速检测出水样中SRB的含量[12]。该方法优点是：检测时间短(仅20 min)；不受溶液中矿化度和有机物残渣的干扰；由于抗体的专一性，检测结果准确度高；操作简单，适合现场作业。缺点是：专一性强，仅仅对SRB有检测效果；检测设备价格昂贵。

2.3.3 PCR技术

随着PCR技术的成熟、操作复杂程度和成本的降低，其应用日趋广泛。马放等[13]申请了SRB直接倍比稀释PCR快速测定方法的专利，以倍比稀释的SRB的菌体为模板直接进行PCR扩增检测。Ben-dov等[14]以SybrGreen为荧光标记,利用腺苷-5′-磷酸硫酸盐还原酶基因(apsA)和PCR扩增异化型硫酸盐还原酶基因(dsrA)对SRB含量进行测定，其原理为：通过引入荧光标记分子SybrGreen，使得反应中产生的荧光信号与PCR产物含量成正比关系，从而实时检测PCR扩增产物。

PCR技术的优点是：检测时间大大缩短；检测结果准确度高，可重复性好。缺点是：技术难度高，需要专业的操作人员；现场检测困难；还需进一步研究水中的杂质干扰因素。

2.3.4 荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)技术

FISH技术不需要对微生物进行培养，它以被测微生物rRNA中高度保守、物种特异性的片段序列作为鉴别微生物的标志并设计合成荧光探针，通过被测微生物rRNA目标特异性片段与合成荧光探针杂交反应，使其荧光标记和探针留在目标微生物胞内，激发出荧光信号，通过检测荧光信号就能检测出微生物在样品中的种类及其含量[15]。曾景海等[16]采用FISH技术对胜利油田采油厂污水中SRPs进行检测，取得了显著成效。

FISH技术的优点是：检测时间短(20 h)；灵敏度高，能计数单个细胞；能联合计算机在线分析，避免了人工分析的误差；检测结果重复性好。缺点是：设备昂贵，成本高；需要专业的操作人员，不利于现场检测。

3 结语

迄今为止，国内外对SRB的检测仍然没有一种公认为比较完善的方法。通过比较分析各种SRB检测技术的优缺点，为选择更为有效的检测方法提供了依据，也为完善检测技术指明了方向。

[1] Phillips L E,Lappin-Scott H M.Enrichment and characterization of sulfate-reducing bacteria from sandstone rock cores from the UK Continental shelf[J].FEMS Microbiology Reviews，1997，20(3-4)：415-423.

[2] Armstrong S M,Sankey B M,Voordouw G.Evaluation of sulfate-reducing bacteria for desulfurizing bitumen or its fractions[J].Fuel，1997，76(3)：223-227.

[3] 山丹,马放,王晨.生态因子对油田注水系统中硫酸盐还原菌生长的影响[J].大庆石油学院学报，2007，31(1)：51-54.

[4] 张小里,刘海洪,陈开勋,等.硫酸盐还原菌生长规律的研究[J].西北大学学报(自然科学版)，1999，29(5)：397-401.

[5] 白莉.硫酸盐还原菌测试液及其测试瓶[P].CN 101 029 328，2007-09-05.

[6] Galbraith J M，Lofgren K L.Update on monitoring microbial corrosion in Prudhoe Bay′s produced water and seawater floods[ J].Material Performance，1987，26(9)：47-49.

[7] 陈蓉,金华,朱杰.油田注水细菌快速测定方法研究[J].石油钻采工艺，2002，24(Z1)：84-86.

[8] 李婉义,赵自光.硫酸盐还原菌菌量检测方法的研究——硫离子选择电极法[J].化学传感器，1991，11(3)：64-68.

[9] 黄彦良，王佳，龚德俊.一种硫酸盐还原菌测量传感器[P].CN 02 275 306.0，2002-09-18.

[10] 李婉义,向望清,郭稚弧.三碘化亚甲基蓝法测定硫酸盐还原菌菌量[J].油田化学，1991，8(3)：250-253.

[11] Odom J M，Jessie K,Knodel E,et al.Immunological cross-reactivities of adenosine-5′-phosphosulfate reductases from sulfate-reducing and sulfide-oxidizing bacteria[J].Appl Environ Microbiol，1991，57(3)：727-733.

[12] Song Young-chae，Piak Byeong-cheon，Shin Hang-sik，et al.Influence of electron donor and toxic materials on the activity of sulfate reducing bacteria for the treatment of electroplating wastewater[ J].Water Science and Technology，1998，38(4-5)：187-194.

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[15] Lücker S，Steger D，Kjeldsen K U，et al.Improved 16S rRNA-targeted probe set for analysis of sulfate-reducing bacteria by fluorescence in situ hybridization[J].Journal of Microbiological Methods，2007，69(3)：523-528.

[16] 曾景海,吴晓磊,赵桂芳,等.油田回注水中硫酸盐还原原核生物的快速检测和群落结构分析[J].环境科学，2006，27(5)：973-976.