EDTA抗凝和加热灭活补体对血型血清学试验的影响

张敬 杨君青 史国爽

盐水法交叉配血和ABO反定型，是红细胞血型血清学的经典常规试验，因操作方便和迅速，为抢救患者争取了时间，可检出临床意义最大的ABO血型抗体，其试验结果的准确性常影响到受血者的生命安全，因意义重大深受临床关注。在实际工作中发现，如果因某种原因延长了孵育时间，有些标本的ABO抗体与相应抗原红细胞结合后会激活补体，导致溶血、凝集强度减弱，甚至呈假阴性结果，严重干扰血型血清学试验结果的正确报告［1］。为找到简单有效地消除血型血清学试验中补体激活导致溶血等干扰现象的方法，笔者进行了大量的试验。本文探讨EDTA抗凝和传统血清56℃加热法对补体灭活及对血型血清学试验的影响，报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般材料 选择来我站329名健康献血者，每份标本各留2管，其中一管按照EDTA真空抗凝管抗凝能力留取一定量的血样于抗凝管中，另一管不加任何抗凝剂。留样后放于4℃冰箱，10 h内检测完毕。

1.2 仪器与试剂 KA-2200小型台式离心机(日本久保田公司);抗人球蛋白试剂多特异性(抗IgG、C3)，单特异性(抗IgG)，单特异性(抗C3)均为上海血液生物医药有限责任公司产品;抗A、抗B单克隆标准抗血清由长春博德生物技术有限责任公司提供(批批检合格，有效期内使用);EDTA抗凝真空管江西洪达医疗器械集团有限公司产品，抗凝能力2 ml全血。

1.3 红细胞悬液 A型和B型献血员各3名的红细胞，等量混合后洗涤3遍，分别用0.9%氯化钠溶液配成3% ～5% 浓度悬液。

1.4 方法 (1)试管法ABO血型定型、直接抗球蛋白试验、效价测定。(2)血清56℃加热灭活处理:将血清置56℃水浴箱，孵育30 min，再进行ABO反定型试验。(3)溶血反应判定标准:抗-A或抗-B与对应抗原红细胞结合后，凡出现肉眼可见的溶血者，均判定为出现免疫性溶血反应。

2 结果

2.1 血型正定型 以试管法对329份标本进行ABO正定型，结果A型95份，B型108份，O型90份，AB型36份，均未出现溶血反应，阳性反应的凝集强度都是++++。

2.2 血清反定型

2.2.1 被检血清2滴加红细胞悬液1滴混合，室温孵育10 min后离心看结果。共14例血清出现溶血占4.26%，其中A型4例、B型3例、O型7例;溶血标本的红细胞凝集强度明显减弱(+～++)。在出现溶血反应的7例O型标本中有5例血清与A型和B型红细胞均呈溶血反应，其余2例血清有1例与A型红细胞呈溶血反应B型红细胞不溶血呈强凝集，另外1例仅与B型红细胞呈溶血反应，而与A型红细胞不溶血呈强凝集。

2.2.2 EDTA抗凝血浆2滴加红细胞悬液1滴混合室温孵育10 min后离心看结果，所有标本管均未见溶血，凝集强度均≥3+。

2.2.3 取室温出现溶血反应的血清各 1 ml，放56℃ 水浴30 min灭活补体，补体灭活后血清2滴加红细胞悬液1滴混合室温孵育10 min后离心看结果，有一管有轻微溶血，其余未见溶血，凝集强度均≥+++。

2.2.4 效价测定:所有出现溶血反应的14例标本分别测定血清、EDTA抗凝血浆和56℃灭活血清的抗-A和(或)抗-B效价。结果56℃孵育后，抗-A(B)效价，下降2个滴度5管，下降1个滴度9管，效价未下降者7管;EDTA抗凝血浆效价基本与血清一致。

2.3 直接抗球蛋白试验 所有14例标本直接抗球蛋白试验多特异性(抗IgG、C3)、单特异性(抗IgG)、单特异性(抗C3)均为阴性。

3 讨论

在ABO反定型试验出现溶血反应的标本中O型血清出现溶血的比例最高且最严重，这可能是由于O型血清中既有抗-A，又有抗-B，且抗体效价相对较高的缘故。溶血标本的红细胞凝集强度明显减弱［1］。

抗-A(B)溶血活性随孵育时间和温度升高而增强，它能造成红细胞弱凝集、溶血甚至假阴性，严重干扰血型血清学试验结果的判定。确保立即离心能从一定程度上避免激活补体，但日常试验中由于种种原因耽误离心，延长了红细胞与血清孵育时间，容易激活补体引起溶血。

补体对温度有一定的敏感性，56℃加热30 min是经典的补体灭活方法，但是本文试验表明，大批标本时该方法不仅操作繁琐、时间长，而且可能会有少数标本中补体不能被全部灭活，过高的孵育温度还可能导致低浓度弱抗体活性丧失而检不出。笔者认为以往传统血清加热灭活补体的方法敏感性低，操作繁琐，不宜常规使用。

血型血清学试验中补体的激活需钙、镁离子参加，因此国外用EDTA钾盐溶液络合钙、镁离子，消除溶血的干扰［2，3］。目前该法已常规用地交叉配血。EDTA不仅防止补体激活，还可以防止高效价抗-A(B)在ABO反定型时出现前带现象(不凝集，即假阴性)［2］。从本实验的结果来看EDTA对血清中的抗体效价没有影响，所以EDTA抗凝血适合用于进行ABO反定型或交叉配血

综上所述，建议用于血型和配血试验的标本常规的采用EDTA抗凝管采血。由于条件所限不能用EDTA抗凝者如发现有因溶血造成的正反定型不符，将血清放56℃灭活补体也可，但要注意温度和时间，以免血清中抗体失活。

1 孙爱农，鲍自谦，曹铁源.红细胞血型血清学试验中溶血现象的消除.现代检验医学杂志，2002，17:20.

2 Judd WJ，Steiner EA，O’Donnell DB，et al.Discrepancies in reverse ABO typing due to prozone.How safe is the immediccte-spin crossmatch.Tranfuion，1988，28:334-338.

3 Shulman IA，Calderon C.Effect of delayed centrifugation or reading on the detection of ABC ineompatibility by the immediate-spin crossmatch.Tranfuion，1991，31:197-200.