ISSR和SRAP标记技术在葫芦科植物种质资源研究中的应用

蹇黎

（贵州毕节学院地理与生命科学院，551700）

葫芦科（Cucurbitaceae）植物一般是常见双子叶瓜类爬藤植物的总称，是食用植物中最重要科之一，仅次于禾本科、豆科和茄科。中国具有丰富的栽培葫芦科植物种质资源，几乎遍及全国各地，共有29余属，142余种，占葫芦科植物的1/4[1]。葫芦科植物不仅具有食用价值，而且还具有很高的药用价值和经济价值。但由于葫芦科植物具有特殊的生长环境和生活习性，如果只靠单一的常规育种手段对其进行品种改良，可能会导致种质资源的匮乏而致使资源的保护利用、研究与推广受阻，从而不能满足市场的需求，因此，解决这些问题必须借助于先进的研究技术与方法。

分子标记是继形态学标记、生物化学标记以及细胞学标记之后发展起来的一种直接反映遗传物质DNA水平多态性的遗传标记，具有基因组变异丰富、标记数量多、目标基因表达不受生物的发育阶段及环境影响、检测手段方便快捷、成本较低等特点，已成为资源系统鉴定与种质资源育种研究最高效的手段之一。ISSR（Inter-simple sequence repeat，简单重复序列间扩增）和SRAP（相关序列扩增多态性，Sequence-related amplified polymorphism）都是基于PCR标记系统的一种新型的显性分子标记技术。ISSR是在微卫星基础上发展起来的[2]，结合了简单重复序列（Single sequence repeat,SSR）标记技术和随机引物扩增多态性DNA（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）标记技术的优点，其引物不但能在种间通用，而且更能揭示物种间的多态性，其检测手段非常方便快捷。SRAP综合了RAPD和AFLP的高效、重复性好、便于目标基因的克隆与测序等诸多优点[3]。ISSR和SRAP标记技术现已广泛应用于葫芦科植物种质资源的亲缘关系鉴定与遗传多样性分析、分子遗传图谱的构建与目的性状基因的标记定位、基因库的构建和基因克隆以及育种辅助选择与品种的纯度鉴定等方面的研究。本文将从以上几方面来综述ISSR与SRAP分子标记技术在葫芦科植物种质资源研究中的应用现状，并对其资源更合理高效的保护和利用进行探讨。

1 ISSR与SRAP原理及特点

ISSR与SRAP分子标记技术是检测种质资源间（内）的基因片段差异性最高效、最理想的遗传标记方法。

1.1 ISSR分子标记

ISSR分子标记是在微卫星基础上发展起来的一种显性遗传标记，结合了SSR和RAPD标记的优点，是在不用知道SSR两端的碱基序列的基础上添加2～4个随机核苷酸。在PCR反应过程中，此引物既保证了锚钉序列位点的退火温度，也可以减少其他靶点的退火几率，对基因组片段的差异进行检测，其扩增产物经过电泳分析进行多态性分析。ISSR标记技术具有其引物可在种间通用、稳定性好、多态性高、无需知道SSR靶标序列信息、重复性好、易操作、快捷方便、成本低等诸多优点。不足之处在于不同引物及不同材料间PCR扩增反应最佳条件可能不尽相同，很难区分显性纯杂合基因型。目前，许多葫芦科植物均建立和优化了各自最适的ISSR-PCR反应体系。

1.2 SRAP分子标记

SRAP分子标记是一种结合了RAPD、AFLP、RFLP等分子标记优点并克服其缺点的PCR标记系统的显性新型标记，是通过独特的双引物（17 bp上游引物和18 bp下游引物）设计对启动子或内含子区域进行特异扩增，其引物具有通用性。该标记是建立在不同种质资源的启动子、内含子与间隔区长度的不同而致使其种间和种内表现出明显的多样性。SRAP分子标记具有多态性高、重复性好、易操作、快捷方便、成本低、在基因组中分布均匀、易对特定序列进行测序与相关基因的克隆等诸多优点。

2 ISSR与SRAP技术的应用

ISSR与SRAP分子标记技术与其他分子技术及传统的常规遗传标记相比较而言，优点更多，已在葫芦科植物种质资源的研究中广泛应用。现将ISSR与SRAP分子标记技术在葫芦科植物中的应用情况进行综述和探讨。

2.1 遗传多样性研究

植物遗传多样性一般是指种间或种内的不同个体的遗传差异之和，是物种生存适应与发展进化的基本特征及物种长期进化演变的产物。研究物种的遗传多样性可以了解与其生长环境之间的关系，采取科学高效的措施保护濒危物种遗传资源基因，认识生物多样性的起源与进化，同时也根据资源的DNA指纹图谱和各个目标性状间的多样性，使其植物种质资源更能合理高效的利用。高山等[4]采用ISSR分子标记技术对38份瓠瓜种质进行遗传多样性分析，12个ISSR引物共扩增出96条多态性带，平均每个引物扩增的多态性带数为8条，多态性比率平均为83.5%。刘万勃等[5]利用ISSR标记对甜瓜种质进行遗传多样性研究，10个ISSR引物共扩增出73条多态性带纹，多态比率为65.51%。王佳等[6]利用ISSR对黄瓜种质资源进行遗传多样性分析，8个ISSR引物共扩增出42条带纹，其多态比率为85.71%。段会军等[7]利用RAPD、ISSR和AFLP对西瓜枯萎病菌进行遗传多样性评价，21个引物共扩增出188条带纹，其中多态性带134条，多态比率为71%。康建坂等[8]运用ISSR分子标记对48个苦瓜样品的遗传多样性进行研究，14个ISSR引物共扩增出181条带纹，其中多态性谱带为113条，多态性比率为60.32%。张爱萍等[9]采用SRAP技术对西瓜种质资源的遗传多样性进行研究，51个引物组合共产生431条扩增带，其中243条带具有多态性，多态性比率为56.4%。陈芸等[10]利用SRAP对甜瓜种质资源进行遗传多样性分析，16对SRAP引物组合扩增出452个位点，其中265个为多态性位点，多态性比率为58.63%。刘军等[11]利用12对SRAP引物组合对丝瓜种质资源进行遗传多样性分析，共扩增出118条多态性带纹。Sikdar等[12]利用同工酶、RAPD和ISSR标记对葫芦科植物遗传多样性分析，10种ISSR引物共扩增出100条多态性带纹。Heikal等[13]利用RAPD和ISSR技术对南瓜属植物遗传多样性进行分析，7种ISSR引物酶共扩增出263条带纹，其中多态带纹为243条，多态性比率为92.4%。Ferriol等[14]利用SRAP和AFLP对西葫芦进行了遗传多样性分析。

2.2 亲缘关系及系统分类研究

ISSR和SRAP分子标记技术能有效地确定葫芦科植物种质资源间的亲缘关系及品种间的遗传距离，进而可以划分杂交种优势群，提高葫芦科植物育种效率。Heikal等[13]利用RAPD和ISSR技术对南瓜属植物的亲缘关系进行鉴定，C.moschata1、C.moschata2、C.pepo5、C.pepo7、C.pepo9 品种之间的亲缘关系最近，而C.pepo1与C.pepo9、C.pepo 5与C.moschata5之间的遗传相似系数最低，亲缘关系最远，ISSR技术将112个南瓜属植物划分为两大类群。钟开勤[15]利用RAPD和ISSR技术对38份瓠瓜种质资源进行亲缘关系分析，其遗传相似系数分布在0.43～0.96，福州芋瓠05与汉龙碧玉02相似系数最大，为0.96，ISSR将38份材料分为5个类群8组，主坐标分析将其分为4个类群10组。陈朝文[16]利用ISSR技术对丝瓜种质资源进行亲缘关系分析，大部分地方丝瓜品种的遗传相似系数为0.7以上，其中明春研三号丝瓜和纯英早青肉丝瓜，早杂二号肉丝瓜和金美肉丝瓜，春研三号丝瓜和长沙肉丝瓜GS值都在0．93以上，亲缘关系最近，此标记技术将162份黄瓜种质资源划分为五大类群。汪伟裁[17]利用ISSR技术对苦瓜种质资源进行分析，武汉品种641和日本品种643相似系数达0.786，其亲缘关系很近。高山等[18]利用ISSR技术对苦瓜种质资源遗传多样性进行分析，将38份苦瓜种质资源划分为三大类群7组，划分类群与形态上以颜色分类比较接近。

2.3 品种及种质资源鉴定

ISSR标记技术和SRAP技术能快速高效地对葫芦科植物品种及种质资源进行鉴定。高山等利用ISSR技术对38份苦瓜种质资源进行分析，10个引物能扩增多态性带纹（200～2 000 bp），其中UCB 835扩增产物多态性比率最高（66.67%），能将品种有效区分。羊杏平等[19]利用RAPD和ISSR标记鉴定了西瓜杂交种的遗传纯度，62个ISSR引物中发现了2个能产生母本特异标记条带的引物（JAASIS27和JAASIS57），分别产生了母本特异标记，检测杂交种苏蜜5号的遗传纯度。王吉明等[20]利用SRAP技术鉴定了甜瓜属植物种间杂交及其杂交后代，1对SRAP引物（E14/M2）扩增出少量父本（西印度瓜）特征带，证明西印度瓜与V129甜瓜已经在DNA分子水平上发生了交换。王从彦等[21]利用SRAP技术鉴定了西瓜种子纯度，32对SRAP引物对5份西瓜杂交种纯度分别为 94.91%，94.18%，94.91%，94.91%，94.64%。王惠哲等[22]应用SRAP技术分析了28份黄瓜的遗传差异，明确在不同的种间和种内存在着一定程度的遗传分化。

2.4 遗传图谱的构建

通过构建葫芦科植物种质资源的遗传图谱来显示其特异基因或遗传标记的相对位置，为系统研究葫芦科植物资源基因组和特异基因的定位克隆提供理论依据。徐晴等[23]利用39个SRAP标记对黄瓜远缘群体进行分子遗传连锁图谱的构建和分析，该遗传图谱覆盖基因组长度为743.11 cM，平均图距4.67 cM，每个连锁群上标记数3～41个，长度8.02～140.16 cM，最大的连锁群含有最多的41个标记，覆盖140.16 cM，平均间距3.42 cM，最小的连锁群含有4个标记，覆盖8.02 cM；平均图间距最大的是第7连锁群，为8.32 cM，最小的是第9连锁群，为2.01 cM。易克等[24]利用38个SSR和10个ISSR引物构建西瓜遗传图谱，总长度为558.1 cM，平均图距为11.9 cM，其中最大的连锁群（s1）由24个标记组成，总长度为 305.7 cM；3 个较小的连锁群（s3，s5，s6）中，标记数为 3～5 个，距离在 28.5～57.3 cM；其余均为2个标记组成的连锁群，11个连锁群中有5个连锁群（s3，s4，s7，s9，s10）。 张仁兵等[25]利用 13 个 ISSR标记用重组自交系构建西瓜分子遗传图谱（15个连锁群），包括1个最大的含31个标记的连锁群（277.5 cM）、6 个大的含 4～12 个标记的连锁群（51.7～172.2 cM）和8个小的含2～5个标记的连锁群（7.9～46.4 cM），覆盖基因组的 1 027.5 cM；2 个标记间的平均距离为11.54 cM。Yeoah等[26]利用SRAP和ISSR标记构建了黄瓜的遗传图谱，覆盖基因组的992.2 cM。

3 结语

目前，虽然葫芦科植物种质资源的保护和育种技术在不断的发展，新的葫芦科植物品种也在不断的育成，但这仍不能满足国内外蔬菜市场的需求。在葫芦科植物种质资源研究方面，随着分子标记技术的完善与发展，该技术能够准确地鉴定、评价和发掘葫芦科植物种质资源的优异特异性状基因；加快葫芦科植物品种的培育、葫芦科植物特异基因的克隆、资源的遗传多样性及亲缘关系的鉴定；能够高效合理地利用和创新优质种质资源，改良其抗病、抗逆、延长成熟期等多种农艺性状来丰富葫芦科植物种质资源的遗传基础。综上所述，ISSR和SRAP分子标记技术均具有操作简便、重复性强、引物通用、多态性好及成本低等诸多优点，但只是应用到部分葫芦科植物种质资源遗传多样性及亲缘关系等方面的基础研究。因此，只有将分子标记技术融入到育种中才能培育出观赏和食用药用价值高的优良新品种。

[1]中国科学院植物志编辑委员会.中国植物志（第七十三卷，第一分册）[M].北京：科学出版社，1985.

[2]Ziedewiez E,Rafalski A,Labuda D.Genome fingerprinting by simple sequence repeats-anhored polymerase chain reaction amplification[J].Genomics,1994,20:176-183.

[3]Li G,Quiros C F.Sequence-related amplified polymorphism (SRAP),a new marker system based on a simple PCR reaction:Its application to mapping and gene tagging in Brassica[J].Theor Appl Genet,2001,103:455-461.

[4]高山，许端祥，林碧英，等.38份瓠瓜种质资源遗传多样性的 ISSR 分析[J].植物遗传资源学报，2007，8（4）：396-400.

[5]刘万勃，宋明，刘富中，等.RAPD和ISSR标记对甜瓜种质遗传多样性的研究[J].农业生物技术学报，2002，10（3）：231-236.

[6]王佳，徐强，缪旻珉，等.黄瓜种质资源遗传多样性的ISSR分析[J].分子植物育种，2007，5（5）：677-682.

[7]段会军，张彩英，李喜焕，等.基于RAPD、ISSR和 AFLP对西瓜枯萎病菌遗传多样性的评价[J].菌物学报，2008，27（2）：267-276.

[8]康建坂，朱海生，李大忠，等.应用ISSR技术分析苦瓜种质资源的多态性[J].福建农业学报，2010，25（5）：597-601.

[9]张爱萍，王晓武，张岳莉，等.西瓜种质资源遗传多样性的SRAP 分析[J].中国农学通报，2008（4）：115-120.

[10]陈芸，李冠，王贤磊.甜瓜种质资源遗传多样性的 SRAP分析[J].遗传，2010，32（7）：744-751.

[11]刘军，许美荣，赵志伟，等.丝瓜种质资源遗传多样性的SSR 与 SRAP 分析[J].中国瓜菜， 2010（2）：1-4.

[12]Sikdar B,Bhattacharya M,Mukherjee A,et al.Genetic diversity in important members of Cucurbitaceae using isozyme,RAPD and ISSR markers[J].Biologia Plantarum.2010,54(1):135-140.

[13]Heikal A H,Abdel-Razzak H S,Hafez E E.Assessment ofgeneticrelationshipsamongand within Cucurbita species using RAPD and ISSR markers[J].Journal of Applied Sciences Research,2008,4(5):515-525.

[14]Ferriol M,Pico B,Nuez F.Genetic diversity of a germplasm collection ofCucurbitapepo using SRAP and AFLP markers[J].Theor Appl Genet，2003,107:271-282.

[15]钟开勤.瓠瓜种质资源的RAPD和ISSR分析[D].福州：福建农林大学，2007：37.

[16]陈朝文.丝瓜种质资源遗传多样性的ISSR分析[D].福州：福建农林大学，2009：45.

[17]汪伟裁.苦瓜种质资源的ISSR分析[D].福州：福建农林大学，2008：49.

[18]高山，林碧英，许端祥，等.苦瓜种质遗传多样性的RAPD和 ISSR 分析[J].植物遗传资源学报，2010，11（1）：78-83.

[19]羊杏平，刘广，侯喜林，等.利用 RAPD和ISSR 2种分子标记鉴定西瓜杂交种的遗传纯度 [J].江苏农业学报，2010，26（6）：1 313-1 318.

[20]王吉明，包文风，尚建立，等.甜瓜属植物种间杂交及其杂交后代SRAP分子标记鉴定 [J].中国瓜菜，2010，23（5）：30-33.

[21]王从彦，李晓慧，胡小丽，等.SRAP技术在西瓜种子纯度鉴定中的应用[J].河南农业大学学报，2008，42（5）：491-495.

[22]王惠哲，李淑菊，管炜.应用SRAP标记分析黄瓜的遗传差异[J].生物技术通报，2009（12）：76-79.

[23]徐晴，张桂华，韩毅科，等.黄瓜远缘群体分子遗传连锁图谱的构建和分析[J].华北农学报，2008，23（1）：45-49.

[24]易克，徐向利，卢向阳，等.利用 SSR和 ISSR标记技术构建西瓜分子遗传图谱[J].湖南农业大学学报：自然科学版，2003，29（4）：333-337.

[25]张仁兵，易克，许勇，等.用重组自交系构建西瓜分子遗传图谱[J].分子植物育种，2003，1（4）：481-489.

[26]Yeboah M A,Chen X H C,Chen R F,et al.Mapping quantitative trait loci for waterlogging tolerance in cucumber using SRAP and ISSR markers[J].Biotechnology,2008,7(2):157-167.