内源性NSPCs与脊髓损伤治疗的研究进展

陈太邦，赵建华

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)造成严重的功能障碍。当前临床上治疗SCI的方法为早期使用大剂量甲泼尼龙防止脊髓继发性损伤，脊柱固定和脊髓减压，加强多个医学学科的联合治疗，规范的康复护理。这些措施虽取得了一定疗效，但迫切需要形成全新的方法解释SCI复杂的病理生理和SCI后的优化恢复。目前已使用的策略包括促进中断神经纤维束的再生及残余神经轴突的萌芽，调理不利的损伤脊髓内环境，运用外周神经或各种细胞移植桥接病灶区，以及以干细胞为基础的治疗补充丢失的细胞类型。细胞替代治疗策略有两类:(1)移植胚胎或成熟神经干/祖细胞(neural stem/progenitor cells，NSPCs)到脊髓病灶区;(2)重新激活和动员成熟的脊髓内源性NSPCs。通过NSPCs分泌营养因子或新形成的少突胶质细胞使残余轴突再髓鞘化促进功能恢复［1］，或通过新生神经元的生成、存活、分化促进功能恢复［2］。然而，以移植为基础的治疗方法有免疫排斥反应，细胞来源、伦理问题和潜在的持续性生长的危险及肿瘤形成等缺陷，而限制了它的应用。

内源性NSPCs参与神经发生的特性让人们看到了其修复SCI的潜能［3］。如何激活内源性NSPCs，促进其在局部增殖、迁移，并通过调控微环境促使其向特定神经细胞组织分化成为SCI研究方向之一。本文就内源性NSPCs增殖、迁移、分化及转归和SCI治疗的国内外研究进展进行综述。

1 内源性NSPCs来源

不同种属哺乳动物的胚胎和成年人类的小脑、中脑、海马、纹状体、皮层、脑室、纹状体、室管膜区(ventricular zone，VZ)、室管膜下区(subventricular zone，SVZ)、齿状回(dentate gyrus，DG)、嗅球(olfactory bulb，OB)、脊髓等处发现有 NSPCs的存在［4］。在病理状态下，如脑缺血、脊髓损伤、神经系统退行性变等疾病可以诱导NSPCs的活化、增殖，并且可诱导成年神经细胞逆向分化为NSPCs。Shibuya等［5］则发现枝状胶质细胞有逆向分化为干细胞的的功能。Kondo等［6］发现少突胶质前体细胞有逆向分化的功能。这些研究提示神经系统损伤后，机体可以通过固有的或者逆向分化而来的内源性NSPCs进行自我修复，这为内源性NSPCs治疗脊髓损伤的研究奠定了理论基础。

2 内源性NSPCs的活化、增殖机制

神经系统损伤能激活内源性NSPCs，使其增殖、迁移到损伤区域并分化，替代受损的细胞，重塑神经组织，最后达到治疗的目的。内源性NSPCs如何激活，在什么情况下被激活，学者们提出各自的观点。

内环境的改变是影响内源性NSPCs活化、增殖的主要因素。Fernando等［7］研究发现成年人类大脑中配体激活的表观遗传标记物组蛋白H2AX在干细胞更新、干细胞巢大小和神经发生中扮演至关重要的角色。α-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid，GABA)受体激活后，通过磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)途径使组蛋白H2AX磷酸化，从而抑制室下区NSPCs的增殖。NSPCs增殖内环境的改变导致了神经系统自我修复能力受限。在病理条件下神经干细胞能不断产生新神经元，此现象称为神经发生(neurogensis)的增加与NSPCs自我更新的增强相关［8］。此外，迁移增殖的祖细胞和神经母细胞的耗竭导致干细胞增殖的显著增加［9］，证明相对缓慢的内源性成年NSPCs的增殖受内环境机制的调控，就是当干细胞巢中NSPCs很少时他们会比细胞多时增殖更快。

病理条件改变内环境可引发内源性NSPCs活化、增殖，体内的细胞因子对内源性NSPCs的作用也是至关重要的。表皮生长因子(EGF)和成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)对神经发生引起了人们的注意。Tureyen等［10］实验评估成年大鼠暂时性大脑中动脉闭塞后这两个因子对缺血后海马DG和SVZ区域NSPCs增殖、存活和表型成熟的附加效应。结果显示，EGF和FGF-2在成年大鼠海马DG和SVZ区域持续灌注5天后增强缺血后NSPCs的增殖，续灌注21d可促进内源性NSPCs的成熟。Kuhn等［11］的实验也证明了这个实验结果。Martens等［12］将 EGF和FGF-2注射到侧脑室后发现能促进脊髓中央管周围内源性NSPCs的增殖。Mikami等［13］移植树突细胞到脊髓损伤大鼠动物模型中的体内试验，发现树突细胞移植对内源性NSPCs的激活作用，体内外实验发现树突细胞分泌神经营养因子神经营养素-3(NT-3)。NT-3可能参与了NSPCs增殖、活化。Nicoleau等［14］提出内源性肝细胞生长因子(HGF)是脑室下区干细胞增殖和自我更新的一个细胞巢信号。

研究发现亲炎症因子，如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1α(IL-1α)和白细胞介素-1β(IL-1β)在SCI后高表达［15］。IL-6受体拮抗剂 MR16-1抑制IL-6信号传导后，小鼠脊髓挫伤动物模型神经功能得以改善［16］。目前主流的观点认为，SCI后的免疫反应会进一步损伤神经组织。为了减少SCI后的免疫反应，甲泼尼龙是目前临床唯一治疗方法［17］。但有些学者提出免疫反应在脊髓损伤修复中起到正面作用。Obermair等［18］的实验发现甲泼尼龙不仅影响巨噬细胞和小胶质细胞的增殖，也减少内源性NSPCs的增殖。研究发现大脑损伤激活小胶质细胞诱导体外神经干细胞增殖及促进神经球来源干细胞分化为神经元和少突胶质细胞。Lu等［19］研究证明免疫激活是NT-3诱导慢性脊髓损伤轴突再生所必须的。TNF-RⅠ和TNF-RⅡ基因敲除小鼠体内实验证明，TNF-α能刺激少突胶质祖细胞和NSPCs的生存和增殖［20］。Butovsky等［21］实验证明 T 细胞诱导激活小胶质细胞增强海马区和SVZ区NSPCs的增殖。从文献我们得知，免疫反应在内源性NSPCs的激活、增殖、分化中也起着至关重要的作用。如何权衡SCI后的免疫反应的利弊将是我们面临的一个重要课题。

3 内源性NSPCs的迁移、分化

神经系统损伤后内源性NSPCs活化、增殖，在体内外因素的共同作用下迁移至损伤区域并分化为神经组织细胞。这些因素有干细胞因子、营养因子、趋化因子、炎症因子等。Belmadani等［22］实验发现炎性刺激物IFN-Y，gp120可激活小胶质细胞和星形胶质细胞合成趋化因子、细胞因子参与NSPCs的迁移。Law等［23］也提出相似的观点并认为这种迁移可能受络氨酸激酶途径的调控。在众多炎症趋化因子中，研究最多的是细胞基质衍生因子(stromal cell-drived factor 1α，SDF-1α)。损伤区域内的反应性细胞如胶质细胞，免疫细胞通过分泌因子影响NSPCs周围微环境，SDF-1α可通过其细胞表面受体CXCR4对SVZ区域增殖的细胞产生化学趋化作用。研究发现SDF-1α主要趋化的是成年神经细胞而Nestin未分化细胞则几乎未发生迁移［24］。Yamashita等［25］研究认为干细胞因子可趋化Nestin未分化细胞迁移。干细胞因子能诱导C17.2NSPCs定向迁移，并且干细胞因子可与其受体C-kit相互作用激活多条信号通路，诱导中枢神经系统内的干细胞定向迁移。Belmadani等［26］实验证明内源性趋化因子单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)能促进NSPCs向损伤处迁移，表明神经损伤后，炎性细胞促进趋化蛋白的表达，引导NSPCs迁移。总之，神经系统损伤后，NSPCs的迁移是多因素相互作用的共同结果。

内源性NSPCs的增殖分化不仅取决于内在因素(基因调控)，而且与损伤局部所处的微环境信号密切相关。在非病理条件下，脊髓NSPCs向少突胶质细胞和星形胶质细胞分化，几乎不向神经元分化，仅在温和的损伤中，如脊髓挤压伤或颈椎背根切断术中可发现有神经元分化［27］，说明脊髓损伤后损伤局部具备内源性NSPCs分化为神经元的微环境，同时也存在抑制内源性NSPCs分化为神经元的抑制因子。这证明NSPCs分化的问题上，局部微环境扮演着重要角色。研究发现广泛分布于中枢神经系统的脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)能刺激迁移的NSPCs的存活并分化为神经元［28］，它是通过酪氨酸激酶受体B(tyrosine kinase receptor，TrkB)受体信号通路调控运动神经元的发育、成年后的存活及病变运动神经元的存活和轴突再生［29］。Wachs等［30］实验证实当 BDNF 浓度为 200ug/L时，NSPCs分化为神经元的比例最高。Mikami等［13］报道移植树突细胞(dendritic cells，DCs)治疗脊髓损伤的体内实验显示，移植了DCs细胞的脊髓损伤小鼠，其内源性NSPCs被激活，引起新的神经发生。研究发现脊髓损伤后，移植DCs可增加NT-3、IL-2等保护性细胞因子的表达，促进运动功能恢复。DCs是通过NT-3直接促进内源性NSPCs的分化还是通过IL-2的作用，文章未给出结论。国内外就NT-3对内源性NSPCs作用的研究很少。而炎症因子在SCI后内源性NSPCs分化中的作用研究较多。NSPCs的体外分化实验显示，当炎症因子IL-6与NSPCs共培养时，NSPCs优先分化为星型胶质细胞。Vela等［31］证明IL-1β抑制少突胶质祖细胞增殖，促进其分化。受IL-4刺激的神经小胶质细胞能诱导NSPCs向少突胶质细胞分化。白细胞抑制因子(LIF)能增加嗅球和SVZ区NSPCs的增殖，减少神经发生，增加脊髓内NSPCs的增殖。

很多实验证明骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)及其同类的受体具有促进胶质细胞生成的活性，但BMP信号受体抑制剂能促进神经元发生。实验证明生长因子胰岛素样生长因子-1(IGF-1)通过高表达BMP拮抗剂Smad6、Smad7、Martens和 Noggin来抑制 BMP，从而刺激海马区NSPCs向少突胶质细胞分化［32］。当BMP被实验性增加时，观察到NSPCs分化为星形胶质细胞的比例增加。最近有报道细胞周期结束后，Yin Yang(YY-1)参与调控NSPCs向少突胶质细胞早期阶段的分化而倍受人们的关注［33］。另一个参与发育和成年人类中枢神经系统增殖和分化的转录因子家族90x，这个家族收到广泛关注［34］。

4 内源性NSPCs的转归与脊髓损伤治疗

内源性NSPCs最终分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞。内源性NSPCs的转归决定脊髓损伤治疗的最终疗效。体内外实验证实，SCI后增殖的NSPCs 99%以上分化为胶质细胞，最后在损伤区形成瘢痕阻断上下行神经冲动的传导［29］。实验证明新生的少突胶质细胞参与髓鞘的形成。根据损伤程度不同，由少突胶质细胞引发的髓鞘再生通常在损伤后14d开始［35］，损伤后1个月轴突再髓鞘化达到顶峰，虽然再生的髓鞘比损伤前短薄［20］。但有学者证明脊髓损伤后新生少突胶质细胞和神经元数周后消失，证明它们并未被整合［36］。如何使新生的神经元存活进行轴突生长并跨越损伤部位及使残存的轴突再髓鞘化最终恢复神经通路，是目前治疗脊髓损伤主要策略。

复习文献发现成年哺乳动物中枢神经系统内细胞因子在脊髓损伤后参与调节神经元的恢复和轴突再生，它们包括生长因子、转录因子、细胞因子及与磷脂相关的抑制分子中和剂。小鼠胼胝体局部脱髓鞘后显示少突胶质祖细胞内的人类表皮生长因子受体(EGRP)的过表达可加速髓鞘再生和功能恢复［37］。Qin等［38］实验证明脊髓损伤后，与免疫调节损伤治疗相关的程序在NT-3诱导的神经元可塑性扮演一个重要角色。髓鞘磷脂特异性T细胞显示能增强海马区、SVZ区甚至脊髓内的神经发生。Vela等［31］证实炎症因子IL-1β抑制少突胶质祖细胞增殖，促进分化，同时通过诱导LGF-1的表达促进髓鞘再生。

5 展望

由此可见，迄今为止人们对脊髓损伤后损伤局部内环境的病理生理改变并未阐明。所以，笔者认为如今的研究更应该侧重于对损伤脊髓本身内环境改变的研究。文献复习发现人们对脊髓损伤后哪些因子参与损伤区内环境的改变及它们分别扮演的角色是什么还不清楚，这是研究SCI治疗的瓶颈。神经营养因子广泛存在于中枢神经系统内，是脊髓内环境稳态的参与者，同时是新分化神经元和原有神经元存活所必须的细胞因子，所以人们试图寻找一种神经营养因子改变损伤部位的微环境，为使增殖的内源性NSPCs存活、分化为神经元少突胶质细胞提供一个有利的环境。众多神经营养因子中，BDNF对内源性NSPCs的增殖、分化、迁移及诱导轴突生长方面作用明显，引起学者们的关注。作为同样是神经营养因子的NT-3，人们对于其对内源性NSPCs的作用的研究甚少。NT-3对内源性NSPCs的作用逐渐引起学者们的注意。如果能明确它对NSPCs的增殖、分化、迁移及诱导轴突生长方面有积极效应，为我们治疗脊髓损伤提供另外一条途径。总之，笔者认为一个理想的、候选的移植到脊髓损伤区能够促进神经元分化和轴突再生的细胞因子应该是自体的，容易获得的，脊髓损伤后在短时间内可进行基因操控的，移植到体内后能激发内源性NSPCs向神经元分化，并有效地支持宿主轴突生长，最终达到治疗脊髓损伤的目的。

［1］ Koblar SA，Turnley AM，Classon BJ，et al.Neural precursor differentiation into astrocytes requires signaling through the leukemia inhibitory factor receptor［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95(6):3178-3181.

［2］ Lepore AC，Fischer I.Lineage-restricted neural precursors survive，migrate，and differentiate following transplantation into the injured adult spinal cord［J］.Exp Neurol，2005，194(1):230-242.

［3］ Arvidsson A，Collin T，Kirik D，et al.Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke［J］.Nat Med，2002，8(9):963-970.

［4］ Pamer TD，Ray J，Gage FH.FGF-2 responsive neuronal progenitors reside in proliferative and quiescent regions of the adult rodent brain［J］.Mol Cell Neurosci，1995，6(5):474-486.

［5］ Shibuya S，Miyamoto O，Itano T，et al.Temporal progressive antigen expression in radial glia after contusive spinal cord injury in adult rats［J］.Glia，2003，42(2):172-183.

［6］ Kondo T，Raff M.Oligodendrocyte precursor cells reprogrammed to become multipotential CNS stem cells［J］.Science，2000，289(5485):1754-1757.

［7］ Fernando RN，Eleuteyi B，Abdelhady S，et al.Cell cycle restriction by histone H2AX limits proliferation of adult neural neural stem cells［J］.PNAS，2011，108(14):5837-5842.

［8］ Kaneko N，Sawamoto K.Adult neurogenesis and its alteration under pathological conditions［J］.Neurosci Res，2009，63(3):155-164.

［9］ Ahn S，Joyner AL.In vivo analysis of quiescent adult neural stem cells responding to Sonic hedgehog［J］.Nature，2005，437(7060):894-897.

［10］ Tureyen K，Vemuganti R.EGF and FGF-2 infusion increases post-ischemic neural progenitor cell proliferation in the adult rat brain［J］.Neurosurgery，2005，57(6):1254-1263.

［11］ Kuhn HG，Winkler J，Kempermann G，et al.Epidermal growth factor and fibroblast growth factor-2 have different effects on neural progenitors in the adult rat brain［J］.J Neurosci，1997，17(15):5820-5829.

［12］ Martens DJ，Seaberg RM，Vander KD，et al.In vivo infusions of exogenous growth factors into the fourth ventricle of the adult mouse brain increase the proliferation of neural progenitors around the fourth ventricle and the central canal of the spinal cord［J］.Eur J Neurosci，2002，16(6):1045-1057.

［13］ Mikami Y，Okano H，Sakaquch M，et al.Implantation of dendritic cells in injured adult spinal cord results in activation of endogenous neural stem/progenitor cells leading to de novo neurogenesis and functional recovery［J］.J Neurosci Res，2004，746(4):453-465.

［14］ Nicoleau C，Benzakour O，Agaasse F，et al.Endogenous hepatocyte growth factor is a niche signal for subventricular zone neural stem cell amplification and self-renewal［J］.Stem Cells，2009，27(2):408-419.

［15］ Pineau I，Lacroix S.Proinflammatory cytokine synthesis in the injured mouse spinal cord:multiphasic expression pattern and identification of the cell types involved［J］.J Comp，2007，500(2):267-285.

［16］ Okada S，Nakamura M，Mikani Y，et al.Blockade of interleukin-6 receptor suppresses reactive astrogliosis and ameliorates functional recovery in experimental spinal cord injury［J］.J Neurosci Res，2004，76(2):265-276.

［17］ Rozet I.Methylprednisolone in acute spinal cord injury:is there any other ethical choice［J］.J Neurosurg Anesthesiol，2008，20(2):137-139.

［18］ Obermair FJ，Schroter A，Thallmair M.Endogenous neural progenitor cells as therapeutic target after spinal cord injury［J］.Physiology，2008，23(5):296-304.

［19］ Lu HX，Li Mj，Qian Y，et al.Retrovirus delivered neurotrophin-3 promotes survival，proliferation and neuronal differentiation of human fetal neural stem cells in vitro［J］.Brain Res Bull，2008，77(4):158-164.

［20］ Iosif RE，Ekdahil CT，Ahlenius H，et al.Tumor necrosis factor receptor 1 is a negative regulator of progenitor proliferation in adult hippocampal neurogenesis［J］.J Neruosci，2006，36(38):9703-9712.

［21］ Butovsky O，Ziv Y，Schwartz A，et al.Microglia activated by IL-4 or IFN-gamma differentially induce neurongenesis and oligodendrogenesis from adult stem/progenitor cells［J］.Mol Cell Neurosci，2006，31(1):149-160.

［22］ Belmadani A，Tran PB，Ren D.Chenmokines regulate the migration of neural progenitors to sites of neuroinflammation［J］.J Neurosci，2006，26(12):3182-3191.

［23］ Law S，Maiti O，Palit A，et al.Role of biomodulators and involvement of protein tyrosine kinase on stem cell migration in normal and leukaemic mice［J］.Immunol Lett，2003，86(3):287-290.

［24］ Barkho BZ，Munoz AE，Li X，et al.Endogenous matricmetallopro teinase(MMP)-3 and MMP-9 promote the differention and migration of adult neural progenitor cells in response to chemokies［J］.Stem Cells，2008，26(12):3139-3149.

［25］ Yamashita N，Uchida Y，Ohshima T，et al.Collapsin response mediator protein 1 mediates reelin signaling in cortical neuronal migration［J］.J Neurosci，2006，26(51):13357-13362.

［26］ Belmadani A，Tran PB，Ren D，et al.The chemokine stromal cellderived factor-1 regulated the migration of sensory neuron progenitors［J］.J Neurosci，2005，25(16):3995-4003.

［27］ Ke Y，Chi L，Xu R，et al.Early response of endogenous adult neural progenitor cells to acute spinal cord injury in mice［J］.Stem Cells，2006，24(4):1011-1019.

［28］ Benraiss A，Chmielnicki E，Lerner K，et al.Adenoviral brain-derived neurotrophic factor induces both neostriatal and olfactory neuronal recruitment from endogenousprogenitor cells in the adult forebrain［J］.J Neurosci，2001，21(17):6718-6731.

［29］ Germana A，Sanchez-Ramos C，Guerrera MC，et al.Expression and cell localization of brain-derived neurotrophic factor and TrkB during zebrafish retinal development［J］.J Anat，2010，217(3):214-222.

［30］ Wachs FP，Sebastien CD，Engelhardt M，et al.High efficacy of clonal growth and expansion of adult neural stem cells［J］.Lab Invest，2003，83(7):949-962.

［31］ Vela JM，Molina-Holgado E，Arevalo-Martin A，et al.Interleukin-1 regulates proliferation and defferentiation of oligodendrocyte progenitor cells［J］.Mol Cell Neurosci，2002，20(3):489-502.

［32］ Hsieh J，Aimone JB，Kaspar BK，et al.IGF-I instructs multipotent adult neural progenitor cells to become oligodendrocytes［J］.J Cell Biol，2004，164(1):111-122.

［33］ He Y，Dupree J，Wang J，et al.The transcription factor Yin Yang 1 is essential for oligodendrocyte progenitor differrentiation［J］.J Neuron，2007，55(2):217-230.

［34］ Wegner M，Stolt CC.From stem cells to neurons and glia:a Soxist＇s view of neural development［J］.Trends Neurosci，2005，28(1):583-588.

［35］ McTigue DM，Wei P，Stokes BT.Proliferation of NG2-positive cells and altered oligodendrocyte numbers in the contused rat spinal cord［J］.J Neurosci，2001，21(10):3392-3400.

［36］ Uchida Y，Nakano S，Gomi F，et al.Differential regulation of basic helix-loop-helix factors Mash1 and Olig2 by beta-amyloid accelerates both differentiation and death of cultured neural stem/progenitor cells［J］.J Biol Chem，2007，282(27):19700-19709.

［37］ Meletis K，Barnabe-Heider F，Carlen M，et al.Spinal cord injury reveals multilineage differentiation of ependymal cells［J/OL］.PLos Biol，2008，6(7):182.

［38］ Qin C，George M，Smith H.Immune activation is required for NT-3-induced axonal plasticity in chronic spinal cord injury［J］.Exp Neurol，2008，209(2):497-509.