A2780细胞染色体着丝粒点变异的研究

曹波

染色体着丝粒点（centromeric dots，Cd）分布于染色体着丝粒区，也被称为动粒子，在借助一定的银染方法的情况下可被染成黑色。染色体着丝粒点为一个三层盘状结构，主要构成为蛋白质成份和少量的着丝粒区DNA[1]。染色体Cd与染色体分离直接相关，它是细胞分裂中纺锤丝微管在染色体上的附着点。非整倍体形成的潜在根源之一可能为着丝粒区Cd缺失[2]，而染色体非整倍性畸变癌是细胞的显著细胞遗传学特征之一。细胞非整倍性畸变的原因为染色体在细胞分裂中不分离或错误分离。Vig在对肿瘤细胞染色体研究中采用过抗着丝粒点抗体免疫荧光技术，结果显示其Cd缺失现象较为普遍，并阐述了造成其非整倍性畸变的新机制为肿瘤细胞染色体Cd缺失[3]。鉴于国内外罕有相关报道，本研究中采用Cd-NOR同步银染技术对人卵巢癌细胞A2780Cd变异进行了分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 实验材料 本研究选用的A2780细胞株来自四川大学华西医学院。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养的方法 将A2780细胞分瓶用RPMI-1640培养液（含10%新生牛血清）放置在培养箱中进行培养，培养环境设置为饱和湿度、5%CO2、温度为37℃，细胞处于对数生长期（备用）。

1.2.2 染色体的制备方法 首先将A2780细胞株经传代后培养48h，接着加入秋水仙素处理培养物6h。将培养液倒掉，采用0.25%胰蛋白酶溶液消化细胞3min、吸管轻轻吹打达到细胞脱壁的目的，然后采用转速为1000r/min的离心机离心10min收集细胞。染色体制备按常用方法进行，在妊娠7～12周孕妇人工流产绒毛中取正常人胚胎绒毛组织，制备染色体标本采用直接法。

1.2.3 染色体的Cd-NOR同步银染方法 首先将制备好的染色体标本放置于室温下10～12d，接着按照Cd-NOR同步银染技术的相关程序制作Cd带标本。

1.2.4 Cd变异分析标准 Cd变异分为小Cd、Cd缺失、Cd迟滞复制或单Cd和Cd-NOR融合。正常状态下，会有2个深染的圆形小体存在于一条中期染色体着丝粒区。小Cd为某条染色体Cd结构与其他染色体Cd结构相比形态小于1/2。Cd缺失为某条中期染色体着丝粒区看不到圆形小体或在着丝粒区边缘只可以看到一个圆形小体。Cd迟滞复制或单Cd为有一个深染小体在着丝粒区正中央。Cd-NOR融合为染色体随体区NOR处的银染物质与D、G组染色体中一条染色体的1个或2个Cd与混合在一起不能相互区分。如果上述情况之一是发生在n条染色体上，则计为n次（n≥2）。

1.3 统计学方法 所有数据均采用SPSS13.0统计学软件进行处理，资料分析中多个样本率差异的比较采用χ2检验，以P＜0.05视为差异有统计学意义，两个样本率差异的比较用χ2分割法，以P≤0.05/2（K-1）=0.0125视为差异有统计学意义。

2 结果

本组中的A2780细胞是典型的非整倍性细胞群，其染色体数目变化最小的为10条，最多的为150多条，主要为50～70条。A2780细胞染色体Cd缺失率、Cd迟滞复制率、小Cd率和Cd-NOR融合率分别为1.41%、0.21%、1.48%和1.61%。A2780细胞Cd变异与人胚胎绒毛细胞染色体Cd变异比较的结果显示：A2780细胞染色体Cd缺失率、Cd-NOR融合率明显高于人胚胎绒毛细胞，χ2检验结果显示两组之间有明显差异（P＜0.0125）；而小Cd率、Cd迟滞复制率两者间没有明显差异。

3 讨论

目前，医学上对恶性肿瘤细胞染色体非整倍性畸变机制并不清楚，存在多种说法。Guimaraes GJ认为“着丝粒爆开”引起染色单体期外分离是其一个形成途径[4]；Ren J等[5]认为的非整倍性畸变机制为：染色体Cd是纺锤体微管附着、运动和细胞周期监控的重要结构区，直接决定着染色体能否分离，没有Cd结构的染色体它的着丝粒功能就会失活，从而不能被纺锤丝附着，导致在分裂中期纺锤丝微管不能附着于染色体上和分裂后期染色体不能正常向两极移动，就引起染色体不分离或错误分离，从而形成了非整倍性畸变。刘彦慧等[6]对一些非癌细胞染色体Cd变异的研究结果显示：Cd缺失的中期染色体易于在分裂后期形成非整倍性畸变。本研究中对A2780细胞的染色体Cd分析结果显示，恶性肿瘤细胞Cd缺失较为常见，而这种现象在非肿瘤细胞中很罕见。这一结果从深层次显示在A2780细胞中存在高频率的Cd缺失的可能相关因素为其非整倍性畸变。

“Cd-NOR融合”是李爽提出的一种新的细胞遗传现象[7]，这一现象可能会对纺锤丝微管与Cd之间的联系产生一定的干扰和阻碍作用，本组中A2780细胞染色体的Cd-NOR融合频率显著升高，这提示它可能是引起该癌细胞染色体非整倍性畸变的一种途径。

Schliekelman M等[8]用其它方法在口腔癌细胞的研究发现在细胞分裂过程中，Cd蛋白成份的缺陷会导致微管对染色体的捕获失败或造成排列障碍，进而引起染色体不分离、丢失或在中期和后期的迟滞，最终导致染色体非整倍性畸变。上述研究反映出染色体不分离风险的增加可能与染色体Cd结构改变有关，染色体Cd结构改变最终会造成非整倍体的发生。Cd受特定基因控制合成，其结构为蛋白质性复合结构，所以那些能引起上述基因活性改变或基因突变的因素都可能导致Cd蛋白合成障碍而出现Cd结构变异现象。某些癌细胞的非整倍性畸变可能仅涉及Cd变异的一种或几种。目前，普遍认为诱发细胞非整倍性畸变的潜在因素就包括Cd缺失。癌细胞中高频率的Cd缺失、Cd迟滞复制、小Cd和Cd-NOR融合表明Cd的这些变异可能是癌细胞非整倍性畸变产生的一种途径。不是全部的非整倍体畸变都一定与Cd变异有关，可能还与其他如纺锤体异常、着丝粒爆开、染色单体迟滞分离等途径有关。目前，还没有确凿证据证明Cd的这些变异为癌细胞一定出现的标记特征，但站在与染色体分离直接相关的Cd结构角度来探索癌细胞非整倍性畸变机制是有意义的。

综上所述，分析恶性肿瘤细胞进行染色体Cd结构变化的具有一定的参考价值，其价值体现在染色体Cd变异分析可以用于肿瘤的早期诊断及预后的评估。

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