猪繁殖与呼吸综合征疫苗研究现状＊

沈武玲，乔自林，令世鑫，冯玉萍，冯若飞，李明生，林学仕，柏家林，王家敏，马忠仁＊

（1.甘肃省动物细胞工程技术研究中心，甘肃兰州 730030；2.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州 730030；3.甘肃省永靖县畜牧局，甘肃永靖 731600）

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）又称猪蓝耳病，是20世纪80年代末暴发的一种新型传染病。1987年美国首次报道了该病的发生，当时称之为猪神秘病（Mystery swine disease，MSD），主要症状是妊娠母猪发热、厌食、早产、流产、死产、木乃伊胎、弱仔等。随后，该病迅速蔓延至欧洲养猪国家，一场空前的流产风暴造成了100万头猪的死亡，使欧美国家的养猪业蒙受了灾难性的经济损失。1991年荷兰学者Wensvoort G等［1］在Lelystad研究所用猪肺泡巨噬细胞（PAM）首次分离到病毒，并命名为Lelystad virus（LV），在第10次国际病毒大会上将该病毒归属于新设立的动脉炎病毒科、动脉炎病毒属。20世纪90年代中期该病蔓延至亚太地区，我国于1995年底在华北地区规模化猪场首先暴发和流行，1996年郭宝清等［2］采用间接免疫荧光法（IFA）从繁殖障碍猪群中证实本病在国内的存在，并用猪巨噬细胞和Marc－145细胞成功分离了猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）。2006年4月，以仔猪高死亡率为特征的高致病性猪繁殖与呼吸综合征在我国南方部分省、市暴发，给我国养猪业造成了较大的损失［3］。2008年6月，曾报道该病在湖南部分地区暴发，呈地方流行性［4］。2010年上半年在我国部分地区发生了以商品猪和母猪死亡率上升为主的所谓"高热病"，甚至在有些地区商品猪的死亡率超过50%，母猪的死亡率也高达5% 以上［5］。该病已在很多省市猪群流行，已成为规模化养猪场繁殖障碍的主要病因。世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须报告的动物疫病，我国将高致病性猪繁殖与呼吸综合征列为二类动物传染病。

猪繁殖与呼吸综合征的流行特点及其病原特性决定了该病一旦在猪群中出现，将很快通过空气和接触及人工授精等途径传播开来，特别是在规模化、集约化、现代化的高密度养猪地区，该病传播尤为迅猛，经济损失更为严重。疫苗的研究和使用是目前预防本病的最主要手段。

1 病原

继Wensvoort等分离到Lelystad virus（LV），欧、美、日学者也相继从表现PRRS类似症状的病猪中分 离 到 VR－2332、IAF－exp91 和IAF－klop 等 毒株，目前国际上将这些毒株通称为PRRSV。PRRSV为有囊膜的单股正链RNA病毒，病毒粒子直径50nm～65nm，核衣壳25nm～35nm，表面有明显的长约5nm的纤突，核衣壳呈立体对称的二十面体。PRSSV有2个血清型，即美洲型和欧洲型，代表株分别为VR－2332株和LV株，2个毒株间氨基酸的同源性为78% ～81%，我国流行的PRRSV均属于美洲型毒株［6］。最近，在东欧发现了与欧洲株属于不同亚型的高致病性毒株，并将其命名为Lena。该病毒的基因组长约15kb，有9个开放阅读框，分别为 ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和 ORF7［7］，病毒基因组相邻的编码框有部分重叠，有帽子结构和poly（A）尾。ORF1a和 ORF1b位于基因组的3′端，长约12kb，占整个基因的75%。ORF2～ORF7在基因组的5′端，ORF2a、ORF2b、ORF3和 ORF4分别编码病毒次要结构蛋白 GP2a、GP2b、GP3、GP4，ORF5、ORF6和 ORF7分别编码病毒主要结构蛋白，即囊膜蛋白 （GP5或E蛋白），基质蛋白（M）和核衣壳蛋白（N）。GP5有6个抗原决定簇，能诱导机体产生特异性中和抗体［8］；M蛋白是非糖基化蛋白，在所有PRRSV株间具性高度保守性，被认为与病毒宿主细胞受体相互作用有关。N蛋白在病毒粒子中含量较高，约占病毒蛋白总量的20%～40%，免疫原性极强，可用于PRRSV感染的早期检测［9－10］。与所有的 RNA 病毒一样，PRRSV 具有高度的变异性［11］，易形成一个异种群，近年来，PRRSV已向高致病性趋势演化［12］。2006年夏季，高致病性猪繁殖与呼吸综合征先是从江西省发病，而后蔓延至周边各省份［13］。

2 灭活疫苗

PRRS灭活疫苗是研制较早的疫苗，1997年Bayer公司就推出了灭活疫苗PRRomiSeTM。目前，国内外已有多种针对美洲型PRRSV株 （CH－1a、ISU－P、JXA1、VD－A1）与欧 洲 型 PRRSV 株（LV、VD－E1、VD－E2）的商品化灭活疫苗，这些疫苗免疫动物都能很好地抵御来自疫苗同源强毒株的攻击［14］，代表产品有Intervet公司生产的PRRomiS4○R灭活疫苗、Boehringer Ingelheim公司生产的Ingelvac PRRS KV○R灭活疫苗和 Merial公司生产的PROGRESSIS○R灭活疫苗。我国在PRRS疫苗的研究起步比较晚。哈尔滨兽医研究所从2000年起用CH－1a株采用转瓶细胞培养技术，在Marc－145细胞上大量增殖了较高滴度（TCID50≥107.0）的PRRSV，经甲醛灭活后制成油佐剂灭活疫苗［15］，用该疫苗免疫接种30头3月龄猪，先后免疫接种2次，间隔20 d，在首免第5天就可检到抗体，第28天抗体达到高峰，第56天抗体仍维持较高的水平。赵坤等［16］研制出了PRRS蜂胶佐剂组织灭活疫苗，临床效果显著。王隆柏等［17］以PRRSV Fuzhou 01株为制苗种毒，经Marc－145细胞增殖、超速离心浓缩、甲醛灭活后，分别制成新型佐剂IMSl312灭活疫苗和油乳剂灭活疫苗，两种疫苗病毒含量约为108.0TCID50／mL，结果表明这两种灭活疫苗对断奶仔猪有良好的免疫原性和安全性。王旭荣等［18］将PRRSV Nsp2基因缺失株Jiangxi－3的第9代病毒按常规方法制成油佐剂灭活疫苗，经肌肉注射免疫PRRSV和猪圆环病毒 （PCV－2）抗原与抗体均为阴性的60日龄健康猪，结果表明，经二次免疫后效果明显。由于猪繁殖与呼吸综合征与其他传染病有混合感染的可能，所以也有二联疫苗的相关报道。金扩世等［19］采用猪圆环病毒（PCV－2）和PRRSV强毒株研制成了PCV－2和PRRSV二联灭活疫苗试验结果表明，用该二联疫苗免疫4周龄仔猪，免疫后7d即可检测到抗PCV－2和PRRSV抗体，免疫后21d抗体可达较高水平，28dELISA抗体和中和抗体均达到高峰，这一结果与报道的PRRS油乳剂灭活疫苗抗体检测结果相似。如今，我国PRRSV疫苗生产厂家是以NVDC－JXA1毒株为种毒生产灭活疫苗。由于PRRSV灭活疫苗的交叉保护性差，针对这一特点，有学者提出研制自家苗的说法，目前还没有实施方面的报告。

3 弱毒疫苗

弱毒疫苗具有抗体产生快、持续时间长、保护力强，改善临床症状的效果比灭活疫苗好等诸多优点。目前，国内外商品化PRRS弱毒疫苗所使用的病毒株主要来源于 ATCC－VR2332、I－1387／8、1－1140、CH－1a、JA－142、5710等PRRSV 强毒株。最早的商品化弱毒疫苗是由德国Boehringer Ingleheim公司的NOBL实验室于1995年研制生产［20］。我国自主研制的PRRS活疫苗是以CH－1a株为原始种毒，通过体外细胞传代致弱得到的，于2007年正式投放市场。2009年，南京农业大学与瑞普生物公司共同研发的PRRS活疫苗（R98株）也被批准为新兽药。有文献报道，将高致病性PRRSV HuN4毒株经Marc－145细胞传112代致弱后，可有效预防仔猪患高致病性PRRSV［21］。PRRSV弱毒疫苗最大缺点就是安全性差，Mortensen S等［22］研究表明，用PRRS弱毒苗接种母猪后，会对母猪的繁殖性能造成不利影响，甚至可通过子宫感染胎猪。Nielsen J等［23］用从胎儿、死胎及死亡仔猪中分离的疫苗源毒感染怀孕晚期母猪，证明疫苗源毒能在猪群中持续存在，并引发疾病。由于存在安全隐患，在欧洲（如德国）禁止用弱毒疫苗来预防PRRS，主要采取扑杀的方法净化猪群。在国内，安全性也是评价PRRS弱毒疫苗的重要指标之一。陈瑞爱等［24］使用高致病性PRRS（JXA1－R株）活疫苗对仔猪进行免疫，仔猪无不良临床表现；使用该疫苗对配种前母猪、怀孕80d～90 d母猪、临产前15d母猪进行免疫，母猪精神、食欲、体温均正常，并在预产期顺利产仔，而且JXA1－R株活疫苗表现出良好的安全性。现在我国很多猪场在使用弱毒疫苗免疫猪群，实践证明不仅能有效地控制了PRRS的发生与传播，减少了经济损失，而且未见发生疫苗病毒毒力返强和基因重组。

4 培养PRRSV用细胞的相关研究

无论是病毒分离、疫苗生产，还是病毒致弱都需要有合适的细胞系。然而，PRRSV对细胞有严格的趋向性，这种趋向性是由细胞表面特异性受体或其它参与病毒侵入的蛋白质决定的，包括硫酸乙酰肝素、唾液酸黏附素（Sn）以及CD163。PRRSV敏感的细胞系的研究较多，最初，研究人员只发现PRRSV能在猪原代肺泡巨噬细胞（PAM）中增殖复制，具较高产量，但成本高。没有敏感的细胞系也给当时PRRSV研究带来了一些障碍，后来一些研究表明PRRSV能在恒河猴胎肾细胞 MA－104中复制。1992年，Collins J E 等［25］利用由 Boehringer Ingelheim Animal Health公司建立的CL2621细胞系分离得到ATCC VR－2332毒株，由于该公司已申请专利，该细胞系的可用性较低。1993年，Kim H S等［26］利用限制稀释法从 MA－104克隆得到 Marc－145细胞，并证明该细胞能用于PRRSV的增殖，目前Marc－145细胞应用较广泛。有学者对 Marc－145细胞病变机制进行了研究，刘伍梅等［27］通过形态学观察证明PRRSV感染的 Marc－145细胞确实发生了细胞凋亡现象。此外，用来培养PRRSV的细胞系还有从Marc145中克隆出来的更为敏感HS.2H细胞系和CRL1171细胞系。2011年，Saqonq M等［28］通过逆转录病毒载体将人类端粒酶逆转录酶（hTERT）cDNA转染至猪肺泡巨噬细胞（PAM）中获得对PRRSV敏感的猪肿瘤细胞系。除寻找对PRRSV更为敏感的细胞系以外，将现有敏感细胞实现大规模培养也是各生物制品公司关注的焦点。工业化大生产所用的动物细胞培养主要包括以下几种技术，滚瓶细胞培养技术、悬浮细胞培养技术和中空纤维细胞培养技术。虽然细胞培养方法有很多种，但是生物制品大规模生产时，悬浮细胞培养技术（包括微载体培养）是最佳培养方法。目前，我国病毒性疫苗的生产多采用大方瓶和转瓶技术培养细胞和病毒，劳动强度高，占地面积大，生产不稳定，难于进行质量控制。但已有不少关于细胞培养大规模生产PRRS疫苗的报道，主要集中于微载体培养，培养过程中各个关键工程参数尤其重要。宫飞等［29］对微载体培养Marc－145细胞的条件进行了优化，以微载体细胞密度4×104个／mg、微载体浓度7mg／mL，在高糖 DMEM （含30mmol／L葡萄糖，6mmol／L Gln）培养基中培养，48h后每12h换液50% 的培养方式效果最为理想。穆光慧等［30］利用Cytodex－3微载体培养 Marc－145细胞并测定PRRSV在微载体培养的细胞上的TCID50，表明细胞接种密度为4.28×105cells／mL 时，病 毒 滴 度 可 达 到 107.5TCID50，证明利用微载体增殖PRRSV是可行的。

5 结语

由于PRRSV具有高度变异的特点，为疫苗研究和疾病防范带来了挑战。在绝大多数省份存在疫情、规模饲养和散养长期并存和牲畜流通频繁及生物安全现状不容乐观的背景下，就我国PRRS流行现状而言，应用疫苗预防PRRS应该是最佳选择。现有的灭活疫苗交叉保护性差，但使用安全，常用于PRRS阴性群或种猪场。弱毒疫苗具有抗体产生快、持续时间长、保护力强，但源毒能在猪群中持续存在，存在安全隐患。2010年，我国PRRS弱毒疫苗进入国家强制免疫计划，疫苗需求量显著增加，因此，实现生物反应器大规模悬浮培养生产是一种必然趋势。由于持续感染、隐性带毒普遍，加上存在抗体依赖性增强作用，导致常规疫苗免疫保护效果较差，研发确实、可靠、高效的新一代疫苗也是未来一个方向。

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