结核分枝杆菌ESX-1分泌系统的研究进展

邓仪昊，何红云，王 勇

（大理学院基础医学院，云南大理 671000）

ESAT-6 secretion system-1（ESX-1）分泌系统是结核分枝杆菌中以分泌ESAT-6（Rv3875）及CFP-10（Rv3874）蛋白为特征的毒力分泌系统。参与该分泌系统的基因包括RD-1（region of difference）区Rv3871-Rv3879 9个基因，Rv3614c-Rv3616c（EspA）3个基因、Rv3881c（EspB）、Rv3867、Rv3849（EspR）、Rv3864、Rv3883c （MyP1）、Rv3868、Rv3869、Rv3870及Rv3882c组成。本文就该分泌系统的组成及其各组分对ESX-1分泌系统的调控进行综述。

1 ESX-1分泌系统的组成

通过比较基因组学分析发现卡介苗（Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin，BCG）与结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）标准株H37RV基因之间存在着16个差异区段〔1〕，即RD1-RD16，共16个区，129个开放读码框，统称为RD（region of difference）区。其中RD1区由Rv3871-Rv3879 9个基因组成，是一个以分泌ESAT-6（Rv3875）及CFP-10（Rv3874）为特征的分泌系统，因此称为ESX-1分泌系统〔2〕，是结核分枝杆菌重要的毒力因子。研究发现，在其编码基因的上下游基因对上述2种蛋白分泌具有重要的调节作用，如Rv3870、Rv3871及Rv3877中任何一个基因敲除均明显影响ESAT-6及CFP-10的正常分泌〔3-4〕。最近研究显示，除RD-1区以外，参与构成ESX-1分泌系统的还包括较多基因区域。Rv3614c-Rv3616c基因区域是参与ESAT-6及CFP-10表达分泌的重要组分〔5〕，当结核分枝杆菌缺失基因Rv3616（EspA）及Rv3615时，ESAT-6/CFP-10表达产物不能分泌至细胞外，在此区域中的任何一个基因缺失或突变，则可导致菌株的毒力下降。RD-1区邻近的基因Rv3881c对ESX-1系统的分泌产生显著影响，对ESAT-6/CFP-10的分泌具有促进作用〔6〕。最近研究发现，Rv3864也是ESX-1的分泌蛋白〔7〕，而Rv3849不仅是ESX-1分泌蛋白，而且是该系统的重要调节因子〔8〕。Rv3868是具有AAA+ATP酶位点假定细胞质伴侣蛋白，Rv3883c（MycP1）是一种枯草杆菌样丝氨酸蛋白酶，均参与ESAT-6向细胞外的分泌〔9〕。

到目前为止，已研究证实确切参与ESX-1分泌系统组成的有：RD-1区基因区域有Rv3871-Rv3879九个基因、Rv3614c-Rv3616c（EspA）3个基因、Rv3849 （EspR）、Rv3864、Rv3867、Rv3868、Rv3869、Rv3870、Rv3881c （EspB）、Rv3882c 及 Rv3883c（MyP1）。随着研究的深入及实验方法的改进，由ESX-1分泌以及调节ESX-1分泌系统功能的组分陆续被发现。

2 ESX-1系统新发现的组分及其调节作用

2.1 Rv3881c（EspB）McLaughlin等将Rv3881c表达蛋白命名为ESX-1分泌蛋白B（EspB），它的分泌需要RD-1区基因Rv3879和Rv3871存在下方可实现，而不受RD-1延伸区Rv3866或Rv3867的影响〔10〕。研究显示，EspB是ESX-1分泌系统的重要组成成分，与结核分枝杆菌的毒性及其在巨噬细胞内的生长密切相关〔11〕。另有研究发现，Rv3881c编码蛋白在ESX-1系统分泌时C端已被切除，提示EspB参与了ESX-1系统的协同分泌。Xu J等〔6〕研究表明，Mh3881c（Rv3881c同源）与ESAT-6及CFP-10呈共同依赖式分泌，而这种共依赖分泌形式与结核分枝杆菌在细胞内存活、及其阻止吞噬体成熟的作用密切相关。

2.2 Rv3614c-Rv3616c（EspA）Rv3614c-Rv3616c区基因是ESX-1分泌系统的主要组分之一，对此分泌系统的功能发挥极其重要的作用。MacGurn等〔12〕发现，当Rv3616c（EspA）和Rv3615缺失时，ESAT-6/CFP-10蛋白可正常表达，但不能分泌到细胞外，提示Rv3614c-Rv3616c对ESX-1分泌系统的分泌功能至关重要。同时，EspA也必须依赖ESX-1系统才能分泌到培养滤液中，提示EspA与ESX-1系统分泌蛋白相互补充和调节。Fortune等〔13〕研究显示，若Rv3614c-Rv3616c中有1个基因被破坏，则可导致结核分枝杆菌的毒力降低，这可能是Rv3614c-Rv3616c的破坏引发ESX-1分泌系统的功能受损，毒力因子未能分泌至细胞外导致的。胞质蛋白Rv3614c与胞膜蛋白Rv3882c相互作用，促进相关ESX-1分泌蛋白的分泌。研究发现，Rv3615c是一种分泌蛋白，其C端是分泌系统ESX-1所必须的，因此，在缺少EspA或Rv3615c时，结核分枝杆菌ESAT-6/CFP-10可形成复合物，但只能停留在细胞内而不被分泌。Rv3616c（EspA）与Rv3614c和Rv3615c形成一个操纵子，同时，Rv3616c（EspA）、Rv3615c与ESAT-6/CFP-10在分泌上相互依赖，互相促进，协同分泌〔14〕。

2.3 Rv3849（ESX-1调节蛋白，EspR）Rv3849（EspR）编码蛋白不仅是ESX-1系统的分泌蛋白，同时可调节ESX-1分泌系统的功能。EspR可直接与Rv3614c-Rv3616c结合，并激活其启动子，使Rv3614c-Rv3616c表达，Rv3614c-Rv3616c的表达可提高ESX-1系统的分泌。与此同时，EspR本身也受到ESX-1分泌系统的调节〔8〕。值得注意的是，当调节因子EspR分泌增加时，Rv3614c-Rv3616c转录反而减少，使ESX-1系统的分泌减少。这样就形成了一个负反馈调节，即EspR分泌增加—导致Rv3614c-Rv3616c转录减少—ESX-1分泌减少—结核分枝杆菌毒性减小，反之亦然。由于EspR的功能主要是调节ESX-1的分泌，所以将它命名为ESX-1调节蛋白。EspR与Rv3614c-Rv3616c形成的反馈调节循环对结核杆菌的毒性及免疫原性至关重要，它对结核分枝杆菌在机体内的长期存活及其在体内诱导的免疫应答均产生较大影响。

2.4 Rv3868 位于RD-1延伸区的Rv3868是ESX-1分泌系统的组成部分，它可增加细胞膜活性，与结核杆菌的毒性及其在体内的存活扩散相关，并参与结核分枝杆菌毒性分子的分泌。Rv3868是具有AAA+ATP酶位点的细胞质伴侣蛋白〔15〕，它可与Rv3870和Rv3871相互作用促进ESAT-6/CFP-10蛋白的分泌。Teutschbein等〔16〕研究ESX-1分泌系统（包括Rv3868-Rv3877 10个基因）中各基因间的相互关系时发现，Rv3866、Rv3868和CFP-10同Rv3873相互作用，共同促进ESAT-6的分泌。另有研究显示，Rv3868、Rv3869、Rv3870、Rv3871及Rv3877编码蛋白对ESAT-6/CFP-10的分泌极为重要，而ppe68、Rv3873及Rv3876的失活并不妨碍ESAT-6的分泌〔17〕。

2.5 Rv3883c（MycP1）结核分枝杆菌感染机体后，正是依赖ESX-1分泌系统的作用将毒性蛋白分泌至宿主细胞。MycP1是一种由Rv3883c编码的丝氨酸蛋白酶〔18〕，可介导转录后ESX-1的分泌。Rv3883c（MycP1）对于维持ESX-1分泌系统的功能来说是必须的〔9〕，当Rv3883c表达受阻时，ESX-1分泌系统假设底物反而增加，这提示作为Rv3883c的可能底物如Rv3881c（EspB）、ESAT-6/CFP-10对维持ESX-1系统的分泌功能是必须的。在动物实验中，MycP1失活后可导致慢性感染的毒性减弱，其与毒性分子分泌呈正相关。在MycP1酶的调节下，使结核分枝杆菌不但具有相当的毒力，而且能使其在机体内长期存活，它在调节ESX-1系统的分泌及其毒性作用方面发挥关键作用。目前Rv3883c作用的确切底物仍不明确，可能是Rv3881c（EspB），或ESAT-6/CFP-10。

2.6其它ESX-1分泌系统重要组分及作用Rv3869、Rv3870和Rv3877分别有1、3、11个转膜位点，这3种蛋白同ESX-1分泌系统的细胞质蛋白Rv3871共形成一个膜结合的ESX-1分泌复合体，依赖ATP水解将蛋白转运至细胞外〔19〕。另外，通过酵母双杂交发现，细胞质蛋白Rv3614c可与膜蛋白Rv3882c相互作用，促进ESX-1分泌蛋白的分泌〔12〕。Rv3864也被研究证实是ESX-1系统分泌蛋白，其功能与Rv3870相协同。Rv3815c是一种分泌蛋白，其C端与CFP-10一样是分泌系统ESX-1所必须的，在缺少EspA或Rv3815c时，ESAT-6/CFP-10复合物可形成，但不能被分泌至细胞外，这提示ESX-1的所有底物（包括ESAT-6、CFP-10、Rv3815c以及EspA等）在分泌时是相互依赖的〔12-13〕。

结核分枝杆菌细胞壁的特殊性，导致其通透性极差且具有高度的疏水性。这使得结核杆菌表达的蛋白必须要在分泌系统的协助下才能分泌至细胞外。近年来，发现了较多蛋白也参与了ESX-1的构成，并ESX-1功能密切关联。因此，ESX-1不再是只包括RD-1区（Rv3871-Rv3879）基因区域的系统，而且包括更多的与ESX-1系统分泌相关基因区域的统称。

3 展望

近年来，对结核分枝杆菌ESX-1分泌系统的研究取得了较多突破性进展，但仍有较多难题需要深入探究：更多的参与ESX-1分泌系统的成分急待发现，以及这些组分对ESX-1系统分泌功能的影响；ESX-1分泌蛋白如何穿过结核杆菌极差通透性和高度疏水性的细胞膜的，即ESX-1的分泌机制尚待进一步研究；Rv3883c（MycP1）与其可能底物Rv3881c（EspB）、ESAT-6及CFP-10间的相互作用机制不明确，它在ESX-1分泌系统中的具体作用；ESX-1分泌系统的调控机制；除ESX-1分泌系统外，结核分枝杆菌还有4类分泌系统即ESX-2-ESX-5，这些分泌系统虽分泌功能是独立的，但各系统间是否有相互促进或抑制作用，各分泌系统间的相互联系有待于进一步的研究。

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