罗格列酮对小鼠急性肝衰竭保护作用的实验研究

司徒小红

本研究通过D-GalN联合LPS腹腔注射构建小鼠急性肝衰竭模型，探讨其诱导急性肝衰竭的可能机制;并以罗格列酮干预，观察小鼠24h存活率、肝组织的病理改变、肝脏酶学水平以及肝组织中TNF-α、TGF-β1的表达，观察罗格列酮对急性肝衰竭是否有保护作用，并研究其可能的作用机制。

材料与方法

1.研究对象 昆明小鼠:6～8周龄，雄性，清洁级，体重2鲍左右，购自南方医科大学动物实验中心，实验前适应性预养一周。

2.主要试剂材料:细菌脂多糖(LPs)，美国Sigma公司;D-氨基半乳糖，重庆医科大学生物医学工程研究室;马来酸罗格列酮片，葛兰素一史克制药公司。

3.主要仪器:全自动紫外分光光度计，美国Beckman公司;电子天平，上海第二天平厂;低温高速离心机，美国PE公司;-70℃立式超低温冰箱，上海天能科技有限公司;全自动生化分析仪，日本sanyo公司;170℃高温烤箱，北京六一仪器厂。

4.构建小鼠急性肝衰竭模型:雄性昆明小鼠100只，随机分为5组，每组分别以 D-GalN 400 mg/kg联合LPS 10 U/kg，D-GalN 500 mg/kg联合LpS 10 μg/kg，D-GalN 600 mg/kg 联合 LPS 10 U/kg，D-GalN 700 mg/kg 联合 LPS 10 μg/kg 腹腔注射，正常组以生理盐水腹腔注射，观察各组小鼠24h存活率。

5.罗格列酮干预:雄性昆明小鼠60只，随机分为A、B、C3组，每组20只，选择罗格列酮20 mg/kg作为治疗剂量。A组为正常组，B组为对照组，C组为罗格列酮治疗组。B组和c组分别予以D-GalN 600 mg/kg联合LPS 10 μg/kg腹腔注射构建小鼠急性肝衰竭模型，c组于造模前2h以罗格列酮20 mg/kg灌胃，B组相应在造模前2h以生理盐水灌胃;A组均在相应时间点予以生理盐水灌胃及腹腔注射。造模后6h，每组随机选择5只小鼠去眼球采血，血标木于37℃水浴半小时后以3000 r/min离心10分钟，取血清保存于-70℃冰箱中，用于待测血清转氨酶;再随机选择5只小鼠断颈处死，无菌取约100mg肝组织置于去酶EP管中并保存于速冻液氮内，再转存于-70℃冰箱，以待提取总RNA;另取小块肝组织于10%中性磷酸缓冲福尔马林液中固定，用于HE染色。

6.血清转氨酶的检测:采用全自动生化分析仪测定丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)。

结 果

1.不同剂量罗格列酮对D-GalN/LPS小鼠24h存活率的影响见表1。

表1 不同剂量罗格列酮对D-GalN/LPS小鼠24h存活率的影响

2.罗格列酮对D-GaIN/LPS小鼠血清转氮酶的影响由表2可见，正常组小鼠血清转氨酶ALT水平为(47.4±6.3)U/L、AST 水平为(62.8 ±5.7)U/L，对照组小鼠血清转氨酶ALT水平为(3664.8±646.1)U/L、AST 水平为(3514.0 ±468.9)U/L，罗格列酮治疗组小鼠血清转氨酶ALT水平为(403.6±76.1)U/L、AST 水平为(464.6 ±63.0)U/L。对照组ALT和AST水平均显著高于正常组，而治疗组ALT和AST水平较对照组显著降低(P＜0.05)。

表2 罗格列酮对D-GaIN/LPS小鼠血清转氮酶的影响

讨 论

急性肝衰竭来势凶猛采取积极、有效的措施阻止病情的迅速进展是治疗的关键所在，这就需要我们更好地了解疾病发生的细胞、分子、蛋白和基因等方面的机制。开发、验证新的治疗方法，除了通过临床研究对人类患者直接观察外，采用动物模型开展实验研究己成为科研攻关不可缺少的手段之一。建立一个成功的急性肝衰竭动物模型，对研究其机理、验证疗效有着非常重要的意义［1］。结果表明，正常组小鼠肝组织仅有少量TNF-α mRNA的表达，对照组肝组织中TNF-α mRNA的表达较正常组显著增强，并与肝细胞炎症坏死程度呈正相关，说明TNF-α和肝细胞坏死有着非常密切的关系，进一步推测D-GalN/LPS可能通过上调TNF-α的表达而导致肝细胞炎症坏死乃至急性肝衰竭。大量的实验已证实在急性肝衰竭中，除了细胞炎症坏死这一死亡形式外，也存在着细胞凋亡。绝大多数的细胞凋亡依赖于caspase的激活，Caspase是一种半胱氨酸蛋白酶，半胱氨酸残基是其催化活性所必需的，目前己鉴定的哺乳动物caspase有14种，在细胞凋亡的执行期发挥关键作用，并与凋亡的形态学特征密切相关。正常情况下细胞内caspase与其抑制剂总是共存的，以免CasPase酶原被意外激活对正常细胞造成损伤。而活化的Caspase能够特异性的水解蛋白底物，从而导致细胞凋亡。因其在凋亡过程中的重要作用，有人认为caspase是凋亡的执行者，亦有人将其誉为“凋亡步兵”或“凋亡刽子手”。

基于罗格列酮具有抗炎、抗氧化和抗凋亡等作用，而急性肝衰竭与肝细胞的炎症、坏死及凋亡有密切关系，故罗格列酮是否也可用于急性肝衰竭的治疗，目前国内外尚未见相关报道［2］。本实验通过罗格列酮干预小鼠急性肝衰竭模型，观察其对急性肝衰竭是否有保护作用。本研究发现罗格列酮可明显降低小鼠急性肝衰竭的24小时死亡率，与对照组比较，死亡率下降40个百分点，差异有显著性。

总之，肝衰竭的发病机制及其复杂，至今尚未找到一种能阻止肝衰竭进展的特效药物［3］。正因如此，紧密结合临床到深入的实验研究，探索肝衰竭的发病机制，并据其发病机制研发更有效的防治手段是肝衰竭发病机制研究及治疗发展的方向，具有重大意义及广阔的前景。目前国内外未见关于罗格列酮治疗急性肝衰竭以及其作用机制的研究报道，故将此研究进一步完善和深入，将为急性肝衰竭的临床研究和药物开发提供一个新的方向［4］。

D-GalN 600 mg/kg联合 LPs l0 μg/Kg腹腔注射成功构建了小鼠急性肝衰竭模型;其可能通过上调TNF-α、TGF-β1的表达导致急性肝衰竭。罗格列酮对D-GalN/LPS小鼠急性肝衰竭有明显的保护作用，可改善肝细胞炎症和坏死，降低急性肝衰竭的死亡率，其机制可能与罗格列酮下调TNF-α、TGF-βl的表达有关。

1 陈立平，周巧玲，欧阳春，等.罗格列酮对糖尿病肾病大鼠足细胞nephrin和 podocin表达的影响〚J〛.中华肾脏病杂志，2007，23(4):263-264.

2 Panchapakesan U，Pollock CA，Chen XM.The effeet of PPAR-gamma agonists on PPAR-gamma expression and function in HK-2 cells〚J〛.Am J Physiol，2004，287(3):528-534.

3 刘章锁，牛红心，程根阳，等.罗格列酮对糖尿病大鼠肾保护机制的研究评论〚J〛.中华肾脏病杂志，2004，20(2):109-112.

4 林茂松，陈卫昌，白霞.罗格列酮对大肠癌细胞生长影响的研究〚J〛.苏州大学学报，2005，25(2):197-200.