微量循环肿瘤细胞检测技术的研究进展

林 丽综述 郑 磊＊审校

肿瘤的发生发展是一个多基因参与，多因素、多步骤的复杂的生物学过程。肿瘤刚发生时多为器官局限性疾病，绝大多数肿瘤组织通过其脱落细胞进入血液循环，进而侵袭其它脏器进行远处转移。早于1869年，Ashworth在一例肿瘤死亡患者外周血中发现了类似肿瘤细胞，并首次提出循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells，CTCs）的概念［1］。CTCs定义是指自发的或者因诊疗操作由实体瘤或者转移灶释放进入外周血中进行循环的肿瘤细胞［2］。CTCs的检测可能有效地应用于体外早期诊断、化疗药物的快速评估、肿瘤复发的监测以及抗肿瘤新药物的开发等。但由于肿瘤患者血液中CTCs数量稀少，大约每105～107个单核细胞中才有一个CTCs［3］，而且其精确分离比较困难，因此限制了CTCs的应用。近年来，随着肿瘤转移机制研究的深入，尤其是伴随现代检测技术的进步，对恶性肿瘤患者筛查并监测CTCs逐渐被临床所重视。目前针对CTCs的检测技术主要包括细胞富集技术和鉴定技术两大类。富集技术主要是通过一些物理或化学原理将这些细胞特异性地收集起来，提高CTCs检测的敏感性；鉴定技术则主要依靠肿瘤细胞上存在的一些肿瘤特异性或器官特异性标记以及肿瘤细胞本身的形态学特征来检测CTCs。在实际操作中常常需要选择两者中的不同方法加以有效结合，以达到较高的检测敏感性和特异性。本文就微量CTCs检测技术的研究进展作一综述。

1 富集技术

1.1 细胞过滤技术 （Isolation by Size of Epithelial Tumor Cells，ISET）

ISET的基本原理是通过过滤工具将不同大小的CTCs和血液中其它细胞分离开来。其中，Vona等［4］建立的膜滤过法是利用上皮肿瘤细胞比外周血细胞大，而将上皮肿瘤细胞分离。该方法敏感度高，1ml血中只掺入1个肿瘤细胞也可检出，分离得到的肿瘤细胞形态完整，表面各种抗原或分子标记保存完好，为后续相关检测提供了良好的条件。此外，该方法对设备、技术要求不高，过程易于掌握。但是膜滤过法只能用于分离直径大于8μm的肿瘤细胞。由于目前还没有报道证实所有的肿瘤细胞直径都大于8μm，使其分离灵敏性受到质疑［5］。而且所富集的细胞中不仅包括肿瘤细胞，也可能有不同种类的其它细胞（特别是单核细胞），使后续细胞鉴定结果出现假阳性，因而限制了本方法的应用。

1.2 密度梯度离心法（Density Gradient Centrifugation，DGC）

DGC和ISET一样，也是运用物理方法富集和筛选有核细胞，其主要原理是采用特定介质在离心管内形成连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力的作用使细胞分层、分离。离心后，从上往下依次是：血浆成分、单个核细胞（淋巴细胞、单核细胞、肿瘤细胞等）、分离液、中性粒细胞和最下层的红细胞。但是如果全血与分离液混合后不立即进行离心，血细胞内有可能掺入分离液而不利于分离，且肿瘤细胞有时可迁至血浆层，造成分离过程中丢失肿瘤细胞［6］。在此基础上建立起来的OncoQuick分离法［7］，虽然对肿瘤细胞的平均回收率更高，富集效果更好，但在分离过程中仍可能丢失少量肿瘤细胞。

1.3 免疫磁珠分选法（Immunomagnetic Separation，IMS）

IMS是基于肿瘤细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单克隆抗体相结合，继而在外加磁场中通过相应抗原抗体复合物与磁珠吸附而滞留在磁场中，没有表面抗原的其它细胞由于不能与连接磁珠的特异性单克隆抗体结合而不能在磁场中停留，从而使肿瘤细胞得以分离［2］。该方法能够从多种细胞中筛选出带有特异性标记的极少量肿瘤细胞。而后发展的磁珠技术多采用上皮细胞黏附分子（EpCAM）抗体来捕获肿瘤细胞［8］，但其不足是EpCAM抗体结合磁珠存在着特异性差、结合能力低、易失活等缺点。针对抗体的缺点，Ellington等［9］用指数富集的配体系统进化技术（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichmen，SELEX）发现了能够特异性结合于染料小分子的RNA配体，并命名为适配体（适体），以指代从SELEX技术中针对靶标系统进化出的核酸配体。适体具有特异性高、亲和力强、易合成、易修饰等特点，因此近些年许多研究者着眼于利用EpCAM适体来提高肿瘤细胞的富集效率［10，11］。也有学者如 Xu等［12］发展了免疫磁珠分离方法，将表达去唾液酸蛋白受体的肝细胞癌（HCC）细胞与生物素化去唾液酸蛋白结合后，再与抗生物素抗体涂布的磁珠一起孵育，使去唾液酸蛋白与蛋白受体-磁珠结合来分离HCC。该方法平均回收率大于61%，较其它分离方法高，且平均每5ml外周血中可检测到19±24个CTCs，是肝癌患者CTCs敏感而特异的分离和计数方法。

2 鉴定技术

2.1 免疫细胞化学法（Immunocytochemistry，ICC）

ICC是利用抗原与抗体特异性结合的原理，使显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素等）标记的抗体与特异的肿瘤标志物如上皮细胞角蛋白（CK）、上皮细胞膜特异性抗原、肿瘤相关糖蛋白（TAG）等结合，通过酶和底物反应显色等方法来鉴定肿瘤细胞的存在。与核酸分离方法相比，免疫细胞化学方法的优点在于肿瘤细胞未被破坏，可以进行后续形态学鉴别或核酸特征分析。但不足之处是缺乏肿瘤特异性抗体，敏感性也低，只能从（1～10）×105个正常细胞中发现1个肿瘤细胞，且每个载玻片上所能检测的细胞载量仅为5×105个细胞［13］，难以从外周血大量单核细胞中检测出极少量的肿瘤细胞，难以满足临床诊断需要。为了能在更大范围检测到外周血中稀少的肿瘤细胞，近年来研发出光纤阵列扫描术（Fiber Array Scanning Technology，FAST）［14］，激光扫描细胞计量仪（Laserscanning Cytometry，LSC）［15］等，它们能够在传统的显微镜技术基础上高速扫描并快速、准确定位免疫荧光标记的肿瘤细胞，使检测敏感性和实用性得到显著提高。

2.2 反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）

PCR技术检测肿瘤患者外周血中CTCs主要是通过检测癌基因、抑癌基因的突变或染色体异位产生的异常DNA。虽然敏感性高［能从（1～10）×106个正常细胞中检测出1个肿瘤细胞］，但是由于其易出现假阳性，适用范围有限，而且外周血中CTCs和核酸的半衰期不稳定，检测到的游离DNA可能并非真正肿瘤细胞，因此应用PCR技术通过DNA标记检测CTCs的特异性不高，在临床实践中还不能达到理想的效果［16］。RT-PCR检测CTCs是在PCR基础上扩增由肿瘤特异性mRNA序列逆转录的DNA片段，从而识别组织或肿瘤特异性mRNA的表达或某些基因改变后RNA水平的异常。这些mRNA几乎不表达于正常外周血细胞，所以在外周血中检测到特异mRNA可以间接提示CTCs的存在。与PCR技术相比，尽管RT-PCR可确认某些基因的表达，提高对肿瘤细胞mRNA表达的鉴别能力，但其存在的取样时上皮细胞污染、肿瘤标志物在外周血的非正常表达或者假基因干扰等原因可导致假阳性结果，另外，RT-PCR无法进行形态学观察及对肿瘤细胞定量是影响它应用于CTCs检测的最大障碍。

2.3 流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）

FCM是一种集激光、电子物理、光电测量、计算机、细胞荧光化学和单克隆抗体为一体的新型技术，主要用于肿瘤细胞DNA分析以及肿瘤相关标志物检测。利用肿瘤细胞单克隆抗体结合荧光物质标记肿瘤细胞，可以对外周血样本中的CTCs进行精确定量计数，以及检测细胞DNA含量，预测肿瘤预后等。具有分析速度快、精度高、准确性好等优点。Fusi等［17］采用FCM探讨了转移性肿瘤（MC）和黑色素瘤（MM）的CTCs中趋化因子受体（CR，包括CXCR4、CCR6、CCR7和CCR9）的表达，结果发现，CTCs的检测效率达到72%，平均每10ml血液中检测到3个CTC；在检测到CTC的患者中，趋化因子受体CXCR4表达最高，达82%，CCR6表达为59%；在MM患者中，CCR9表达为57%，而CR7表达只有29%，这种准确测量表明CTC与细胞表面CR表达呈正相关，与器官特异性转移模式无显著相关性。Hristozova等［18］利 用FCM 分析CD45的EpCAM 和CK阳性的CTC对晚期头颈部鳞状细胞癌（SCCHN）传播的作用，结果显示这种CTCs与头颈部鳞状细胞癌区域性转移有关。不过，单纯依赖FCM测定CTCs的敏感性仍存在争议，建议通过与细胞富集技术（如磁珠富集）联合，以提高FCM的敏感性和鉴别力，提高CTCs的阳性检出率。

2.4 微流控技术（Microfluidics）

芯片实验室（Lab-on-a-Chip）是一个新兴领域，原则上所有生物与化学实验室功能的微型化手段都可以用“芯片实验室”技术来指代。而其概念中的代表性技术就是针对小尺度液体操控的微流控技术。微流控技术可在微米级结构中操控纳升至皮升体积流体，是近十年来迅速崛起的前沿交叉学科。Xu等［19］即用聚对二甲苯-C槽微流控装置捕获了有活性CTCs中的端粒酶。使用一个衡量低压传输系统的新微流控技术平台能在5min内从1ml全血实现90%CTCs捕获和90%细胞活力。更重要的是，捕获的CTCs经扫描电子显微镜观察，其形态保持正常。此方法能捕获和鉴定有活性CTCs，具有快速、简便且准确定量的优势，而且适用于任何实体瘤，有望成为一种新的CTCs定量检测和表征方法。

Lin等［20］将健康志愿者血标本中掺入肿瘤细胞，来评估微流控技术捕获CTC的敏感性，发现微流控装置能从掺入5个CTC的7.5ml血中，至少检测到1个CTC，并有大于90%的复苏率。较多研究者［21～24］在微流控技术，特别在联合运用适体或磁珠微流控技术检测肿瘤细胞做了很多工作，有力地推进了微流控技术的发展和应用。目前基于微流控技术用于检测肿瘤细胞最有运用前景的是微流控芯片，它把生物和化学等领域所涉及的样品制备、生物与化学反应、分离与检测等基本操作单元集成到一块几平方厘米的芯片上，具有快速、高效、高灵敏度等诸多优点，是实验室分析的优良工具。微流控芯片技术进行CTCs检测尚处起步阶段，在芯片设计、材料选用、检测技术联用等方面仍存在许多不足，但它的出现已为CTCs检测技术的发展提供了新的方法和思路。

3 富集与鉴定技术的结合

如上所述，目前用于CTCs检测的方法很多，实际临床应用中常常选择不同方法的有效结合，使用最多的也是目前自动化程度最高的 系统［25］，该系统集免疫磁珠富集技术和免疫荧光技术于一体，人为因素干扰较少，具有较高的特异性、敏感性及可重复性，是目前唯一被美国FDA批准用于转移性乳腺癌、结直肠癌或前列腺癌CTCs检测的新技术［26］。其主要原理是用一种携带铁微粒的抗体与CTCs特异性结合，再用强磁体将这些CTCs从血液样本中提出，并进行生物或化学染色，从而准确识别CTCs。CellSearch系统检测CTCs的效果已被许多研究者用于临床，Gazzaniga等［27］用CellSearch系统分析CTC对非肌肉侵蚀性膀胱（NIMIBC）的影响，发现CTC的存在与NIMIBC首次复发的时间长短密切相关；NIMIBC中检测CTC能区分高复发风险，有利于肿瘤的早期诊断。Farace等［28］用CellSearch系统和ISET检测了转移性乳腺癌、前列腺癌和肺癌共60例患者的CTCs，结果显示乳腺癌CTCs检测率55%、前列腺癌60%、肺癌20%，这种差异主要取决于肿瘤类型。

最近，许多学者研究了一些新的用于检测CTCs的方法。Hughes等［29］设计的检测CTC的微量流动装置是利用E-选择素和针对上皮细胞的抗体分子，采用埃洛石纳米颗粒和纳米材料合成，该装置CTCs捕获率大约为50%，可以从3.75ml样本中分离到20～704个CTC，高于CellSearch系统的捕获率（P＜0.01）；Kirb等［30］发明了一种提高捕获率，减少非特异性细胞黏附的方法——GEDI（几何学提高特异性免疫捕获）微流量装置，该装置将前列腺特异性膜抗原（PSMA）抗体和3维（Three Dimensional，3D）立体几何学结合，结果显示该装置敏感度比CellSearch系统提高2～400倍；还有研究者［31］将邻位连接技术（PLA）和针对细胞表面的特异性RNA适体结合起来用于检测CTCs，结果发现这种方法能特异地检测和区分特异性表达前列腺癌膜抗原（PMA）的肿瘤细胞，虽然特异性和敏感度不够明确，但其应用前景还是十分乐观的。

4 小 结

近年来，CTCs检测作为一种可重复的非侵入性诊断工具，在实体瘤转移的早期诊断及预后评估中发挥着越来越重要的作用。目前CTCs的检测方法多种多样，在一定程度上满足了临床需求，但都存在一定的缺点而影响其广泛应用，如PCR被认为是检测CTCs和转移性肿瘤的理想而常规的技术之一，然而PCR阳性并不意味着疾病复发；联合RTPCR、流式细胞术和免疫细胞化学方法能大大提高肿瘤细胞的临床价值，但真正已经进入临床的只有CellSearch系统，其它方法仍处于研究阶段。而临床诊断却渴求更为快速、简便的分析方法来捕获特异性CTCs。新技术的出现将给CTCs检测方法的发展带来机遇，如微流控芯片的出现为CTCs检测实现临床个体化治疗提供了新的技术平台，而PLA和适体联用也将成为未来CTCs检测研究的热点。总之，CTCs检测有望成为一种具有高度可行性、信息含量丰富且准确的新型诊断方法，从而为肿瘤患者的诊治带来新的希望。

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