隐球菌形态学变化及其致病机制

潘搏，陈敏，潘炜华，廖万清

上海长征医院皮肤病与真菌病研究所/上海市医学真菌分子生物学重点实验室/全军真菌与真菌病重点实验室/第二军医大学附属长征医院皮肤科，上海 200003

致病真菌在与宿主相互作用过程中会发生形态学改变，如白假丝酵母在不同感染阶段会产生假菌丝和真菌丝，这种形态学变化与真菌的组织嗜性和系统播散有密切关系。菌丝形态可增强真菌在组织中的侵袭性，酵母形态则有助于真菌通过血液和淋巴系统形成系统播散[1]。而双相型真菌如组织胞浆菌和皮炎芽生菌表现出温度介导的形态变化，在体外环境中表现为菌丝态，在人体37 ℃体温下表现为酵母相。

隐球菌病是由隐球菌引起的一种严重深部真菌病，世界各地均有流行，每年约造成62万人死亡。常见的致病隐球菌主要有新生隐球菌(Cryptococcusneoformans)和格特隐球菌(Cryptococcusgattii)，其他少见的致病菌包括罗伦隐球菌和浅白隐球菌。中枢神经系统、肺和皮肤是该病的常见感染部位。与其他真菌相比，隐球菌菌体外周有荚膜包绕，这是其最显著的形态学特征，也是直接通过脑脊液墨汁染色诊断该病的原因之一。同时，荚膜是隐球菌的主要毒力因子，会随着所处环境的不同发生结构变化，这有利于隐球菌适应环境压力。此外，隐球菌孢子(spore)形成和巨大菌体的变化与该病的发生也有密切关系。本文就隐球菌的形态学变化与其致病机制的关系进行综述。

1 孢子形成与吸入感染

目前认为，隐球菌的自然感染途径主要是呼吸道吸入方式。在宿主免疫缺陷时，被吸入的隐球菌无法被免疫细胞清除，随之播散到其他组织器官，包括中枢神经系统[2]。环境中干燥的隐球菌和隐球菌孢子被认为是可能吸入的病原菌原型。但干燥的隐球菌(直径3 μm)易在环境播散过程中死亡，而隐球菌孢子(直径1～2 μm)有更好的环境适应能力，更易在外界环境中存活和被宿主吸入[3-5]。

隐球菌孢子可通过2种不同途径生成，即有性交配(sexual development)和单核体结实(monokaryotic fruiting)。有性交配过程是隐球菌α和a交配型(MATα和MATa)的单倍体细胞在合适外界环境中发生融合，产生菌丝，其末端菌丝细胞分化为担子，经核融合和减数分裂在担子表面产生孢子长链[6]。这种有性生殖方式更有利于2种交配型孢子的产生和播散[6]。而单核体结实则发生在外界营养匮乏的情况下，即使没有MATa交配型，2株MATα间也可发生同性交配，细胞融合生成单核菌丝，再通过减数分裂产生重组担孢子[7]。1999年至今在温哥华岛暴发流行的隐球菌病多累及免疫力正常的宿主，对致病菌交配型位点基因分析发现，主要致病株VGⅡa亚型隐球菌由MATα交配型的格特隐球菌同性交配产生。有学者认为，这种单核产物的生殖方式可能会增强隐球菌的毒力[8]。

由于既往缺乏分离隐球菌孢子的手段，没有对这种有性孢子进行深入研究。随着显微解剖技术(microdissection)和密度梯度离心方法的出现，为研究该菌孢子生理、生化特性和模拟自然感染过程提供了可能[3,5]。电子显微镜下隐球菌孢子有很厚的孢壁(spore coat)，而干燥隐球菌没有该结构[3]。孢壁使孢子拥有很强的抵抗外界伤害的能力。与干燥酵母细胞相比，它更能抵御干燥、高温的环境[3]。

隐球菌吸入感染小鼠模型显示，500个新生隐球菌孢子足以造成致死性感染[5]。但与吸入酵母样菌体的小鼠相比，吸入孢子的小鼠在感染3 d和6 d后肺内菌体量明显减少，说明隐球菌孢子可能更容易被免疫细胞吞噬[4]。孢子与小鼠巨噬细胞共孵育的实验也显示，这种孢子更容易被巨噬细胞吞噬，且这种吞噬作用不依赖调理素(opsonin)介导[4,5]。进一步研究发现，这种吞噬孢子的作用由隐球菌孢子β-1,3-葡聚糖、巨噬细胞dectin 1受体和白细胞黏附分子CD11b所介导[4]。虽然巨噬细胞的吞噬作用可杀灭病原菌，但在缺少脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和γ干扰素(interferon γ, IFN-γ)活化巨噬细胞的情况下，部分被吞噬的孢子可在巨噬细胞内萌发(germination)和增殖。在上述2种物质活化巨噬细胞的情况下，胞内隐球菌孢子被快速杀灭，这种杀伤作用依赖于巨噬细胞内活性氧和活性氮(reactive oxygen and nitrogen)[4]。而孢子萌发后形成的酵母样细胞可抵抗上述2种物质的杀伤[9]。越来越多的证据显示，隐球菌在巨噬细胞内生存与其在宿主体内播散、致病有密切关系[10,11]。

隐球菌孢子易被巨噬细胞吞噬和杀灭与其在动物模型中的致病能力相互矛盾。Botts等提出一种动态模型(kinetic model)来解释这种“矛盾”。他们认为，尽管巨噬细胞活化使大多数胞内孢子被杀灭，但少数未经活化的巨噬细胞内孢子暂时逃避了这种杀伤作用[9]。这些未被杀灭的孢子在巨噬细胞活化并萌发，形成能抵抗巨噬细胞杀伤的酵母样细胞并将巨噬细胞作为“特洛伊木马”(Trojan horse)造成全身播散[10]。在该动态模型中，巨噬细胞活化是隐球菌孢子能否致病的关键所在。免疫功能正常的宿主可及时杀死和清除胞内的萌发孢子，使宿主免于感染；而免疫功能受损的宿主无法在孢子萌发“窗口期”(window of germination)内激活初始免疫反应而及时杀伤孢子，使孢子萌发形成可抵抗巨噬细胞杀伤作用的酵母样细胞[9]。如获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrom，AIDS)患者体内CD4+T细胞和肺泡巨噬细胞因受病毒感染，天然免疫反应低下或延迟，从而成为易感人群[12]。

由于肺泡巨噬细胞是隐球菌侵入宿主所面临的第1道防线，隐球菌突破该防线的过程等同于孢子萌发与宿主天然免疫“赛跑”的过程，其结果决定了吸入肺内的隐球菌是被宿主清除还是在胞内存活及致病。

2 荚膜变化与环境适应

如前所述，菌体外包绕的厚壁荚膜是隐球菌最显著的形态学特征。隐球菌的荚膜主要由葡糖醛木甘聚糖(glucuronoxylomannan, GXM)、半乳木糖甘露聚糖(galactoxylomannan, GalXM)和甘露糖蛋白(mannoprotein)组成。不同血清型的隐球菌荚膜GXM成分及总木糖、甘露糖和葡萄糖醛酸摩尔比值不同。

研究发现，与野生株相比，隐球菌荚膜基因缺陷的菌株感染能力下降。荚膜大小与生长环境有密切关系，标准培养基和外界环境中隐球菌荚膜较小，而宿主肺泡内和巨噬细胞内隐球菌荚膜体积明显增大[13,14]。体外实验发现，环境中CO2浓度升高、铁离子浓度降低、营养匮乏时，荚膜会显著增大。另外，环境渗透压、pH值和二价离子浓度变化也会影响荚膜体积[15]。最新研究发现，隐球菌与巨噬细胞和阿米巴原虫共孵育时会导致荚膜变大，此过程由共孵育细胞的磷脂类物质介导，这是首次发现能介导隐球菌荚膜变化的宿主自身分子[16]。

Zaragoza等用补体标记荚膜和放射性氚标记甘露糖的方法研究了荚膜增大的动态变化，发现在荚膜增大过程中原有荚膜位置不变，仍紧贴细胞壁，在其外侧产生新生荚膜[17]。动态光散射技术揭示了荚膜增大的分子机制，发现隐球菌生成的荚膜多糖(包括GXM和GalXM)分子的有效直径(effective diameter)与荚膜直径呈线性关系，荚膜变大的过程也是上述多糖分子有效直径变化的过程[18]。

隐球菌胞壁外的荚膜、脱落至宿主内环境中的荚膜和吞噬细胞内脱落的荚膜可通过多种机制保护隐球菌免受宿主杀伤。巨噬细胞的吞噬和杀伤作用是天然免疫过程中至关重要的环节。已有研究发现，隐球菌荚膜体积与抗体和补体介导的巨噬细胞吞噬作用呈负相关。即荚膜越大，越不易被吞噬[19]；且荚膜增大后，内层原有荚膜密度增大，可明显减少外源性物质的渗透[17]。此外，在培养基和宿主体内均发现隐球菌存在荚膜脱落现象，这种脱落至宿主内环境中的荚膜多糖与隐球菌胞壁外的荚膜成分和性质均不同[20]。脱落的荚膜可调节宿主免疫功能，如这些荚膜中的GXM和GalXM可诱导巨噬细胞和T细胞凋亡[21]。在巨噬细胞内生存、增殖有助于隐球菌逃避宿主免疫和抗真菌药物的杀伤作用。但巨噬细胞内环境恶劣，隐球菌需要表达一系列毒力因子来适应细胞内环境。实验证明，隐球菌被巨噬细胞吞噬后荚膜体积显著增大，增大的荚膜可帮助其抵御巨噬细胞内氮、氧自由基的杀伤作用，这种抵抗杀伤的作用与荚膜大小成正比[14]。

由此可见，隐球菌荚膜体积的变化与外界环境息息相关。增大的荚膜可通过自身体积增大和结构变化增强隐球菌抵御外界不利生存环境的能力。

3 巨大菌体与潜伏感染

在宿主体内，除可观察到隐球菌荚膜的形态学变化，还可见菌体变大的现象。这种变大的菌体体积(不包括荚膜)是酵母样隐球菌的5～10倍。另外，大菌体隐球菌还表现出细胞壁增厚、染色体数目增加和抗氧化损伤的特性，所以有学者将其称为“titan cell”[22]。其实，先前就有学者在隐球菌患者的肺、脑和脑膜组织中发现这种巨型隐球菌，菌体直径可达25～30 μm，而体外培养的酵母样隐球菌的菌体平均直径为4.5 μm，但当时未对其产生原因进行深入研究[13,23]。

最近2项研究通过分析经呼吸道感染小鼠肺组织中的巨型隐球菌，揭示了这种形态学变化在隐球菌致病过程中的作用[22,24]。Zaragoza等发现，经呼吸道感染的免疫力正常小鼠，肺组织中巨大菌体占所有隐球菌的10%～80%，且肺内隐球菌接种量的多少与巨型隐球菌产生比例成反比[24]。Okagaki等发现，小鼠经呼吸道接种隐球菌3 d后，肺组织中菌体直径>10 μm的隐球菌约占20%，部分菌体直径甚至达到50～100 μm(不包括荚膜)[22]。将这种巨大菌体的隐球菌置于体外培养基培养时，它仍保持自身巨大形态，但可通过出芽、生殖，快速产生小的酵母样子代隐球菌[24]。同时，这2项研究发现巨型隐球菌是单核多倍体(四倍体或八倍体)，DNA含量和染色体数目较一般隐球菌明显增多，这是因为隐球菌形态变化过程中发生不伴随细胞分裂的DNA复制(DNA replication without fission)[22,24]。由此可见，隐球菌巨大菌体的形成与隐球菌独特的细胞周期调节方式有关，但具体机制尚待研究。

培养过巨噬细胞的培养基和缺铁条件均可在体外诱导巨大菌体形成[24,25]。在研究新生隐球菌交配型过程中发现，隐球菌MATα菌株产生的信息素(pheromone)可使交配型MATa隐球菌菌体变大，而MATa产生的信息素可使MATα形成萌发芽管(germ tube)[26]。Okagaki等发现MATa和MATα单独感染时均可在小鼠肺组织中形成巨型隐球菌，但两者混合接种于小鼠肺内会使更多的MATa型隐球菌菌体变大，而发生形态学改变的MATα菌比例同前[22]。最近研究发现，巨大菌体的产生受2种G蛋白耦联受体﹝Ste3a信息素受体(pheromone receptor)和Gpr5 受体﹞调控，这2种受体通过cAMP/PKA信号转导途径调节转录因子Rim101，导致隐球菌细胞周期和分裂方式改变，产生巨大菌体[25]。由此可见，隐球菌菌体变化是由外界环境和宿主内环境共同介导的复杂过程。

在巨型隐球菌与巨噬细胞共孵育实验中发现，因为体积过大，巨噬细胞无法吞噬这种巨型隐球菌。鉴于巨型隐球菌多存在于免疫功能正常的小鼠体内，并与致病菌接种量成反比，且在合适条件下可产生子代细胞，有学者认为这种巨型隐球菌作为隐球菌感染阶段的一个亚群(subpopulation)，是呼吸道隐球菌潜伏感染的原型[22,24]。巨型菌体可保护隐球菌不被宿主巨噬细胞吞噬，延长在宿主体内胞外潜伏时间，且自身内复制产生的多倍体可使其在合适条件下快速产生子代细胞[24]。吸入感染造模过程显示，吸入感染1 d后即可在小鼠肺内发现巨型隐球菌，感染7 d后巨型隐球菌所占比例趋于稳定，说明巨型隐球菌可能仅在感染早期发挥作用[22]。而在不同交配型共感染实验中，虽然肺内MATa巨型隐球菌比例增加，但对感染小鼠的生存时间无影响[22]。这些结果均提示巨型隐球菌潜伏感染存在的可能。

类似的潜伏机制也存在于肺孢子菌(Pneumocystis)和球孢子菌(Coccidioides)的致病过程中。肺孢子菌和球孢子菌可在宿主体内分别生成孢囊(cyst)和内孢囊(spherule)，抵御肺泡巨噬细胞的吞噬，并能在孢囊成熟后发生破裂，释放其中所含的孢子从而致病[27,28]。而隐球菌巨大菌体也可抵御巨噬细胞的吞噬，且可在合适条件下快速出芽、生殖，产生子代细胞。这与前两者的潜伏机制有异曲同工之处。

4 展望

抵抗力强、体积小的隐球菌孢子有利于通过吸入途径进入宿主体内，而巨大菌体形成和荚膜变大分别在潜伏感染和适应环境过程中发挥重要作用。新技术的出现为人们研究隐球菌形态学变化的意义提供了可能，可直接观察致病菌与宿主细胞相互作用的过程。目前仍需更多研究从分子和基因角度阐述这些过程，这对防治该病有重要意义。另外，还有许多问题需要人们去探索，如孢子吸入与潜伏感染之间的联系，两者是承前启后的关系，还是平行进行的？同时，人类和动物并不是隐球菌的主要生态环境(ecologic niche)，隐球菌进化拥有的这种形态学变化能力可能并不是用于抵御非天然宿主的免疫反应，这提示人们寻找其他天然模式生物(如阿米巴原虫、蜡蛾)来更好地研究隐球菌形态学变化的分子调控机制[16]。

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