环境污染物的生态毒理学研究方法进展

林枝，车宝光，王学东，张洪勤，王慧利

（温州医学院 生命科学学院，浙江 温州 325035)

环境污染物的生态毒理学研究方法进展

林枝，车宝光，王学东，张洪勤，王慧利

（温州医学院 生命科学学院，浙江 温州 325035)

生态毒理学；组学技术；生物标志物；进展；综述文献

随着现代工业的迅速发展和农业现代化、集约化的不断增加，污染物进入到生态系统中的数量和种类日益增加。如农药、兽药、饲料添加剂、抗生素等在环境中蓄积、迁移和降解而对整个生态系统产生广泛而深远的影响。现今新型污染物的种类不断增加，如多环芳烃（PAH）、多溴联苯醚（PBDEs）、全氟辛烷磺酸（PFOS）、全氟辛酸（PFOA）、酚类环境雌激素（PEE）等，都具有残留期长、环境毒性大、不易降解等特点，致使在生态环境中长期积累成为持久性有机污染物（POPs），对周边生物包括人的健康造成严重威胁。面对复杂污染物的环境隐患，环境工作者准确评价其生态风险的技术和方法也在不断更新和完善。环境污染物的生态毒理学是20世纪70年代初期发展起来的一个毒理学分支，是生态学与毒理学之间相互渗透的一门边缘学科。它主要研究环境污染物以及各种不良生态因子的暴露对生命系统产生的毒性效应，以及生命系统反馈解毒与适应进化机制及调控作用，其特征是将宏观生态理论与微观机制结合起来，到目前为止，在这方面的研究已积累了丰富经验，取得了丰硕成果。现就污染物毒理学研究方法的进展作一综述。

1 常规群体暴毒试验(群体水平上的研究)

环境污染物在生态系统中经历一系列复杂的理化和生物的变化，产生固有毒性、积累毒性、生物放大毒性和潜在毒性等，要正确评价其环境安全效应，最基本的方法就是对生物群体进行体内或体外的暴毒实验，这种方法从宏观角度、群体水平上，能更客观直接地评价污染物的环境安全性和毒性效应。比如吴声敢等[1]选择啶虫脒、丙溴磷、二嗪磷和马拉硫磷4种杀虫剂对斜生栅列藻、大型溞和斑马鱼3种水生生物进行急性毒性试验。生物体在环境污染物的胁迫下，不管是药物直接致毒还是代谢产物致毒，其毒理学终点都是对生物体的生长发育和繁殖的影响，及其致畸、致癌、致突变等现象的评判，量化的指标为致死率、生长抑制率及致畸率等。因此，常规群体暴毒试验是毒理学研究的第一步，韩建等[2]研究PFOS/PFOA急性毒性实验，表明PFOA是低毒性化合物，估计雄性和雌性大鼠的LD50分别为>500 mg/kg和250～500 mg/kg。

常规暴毒检测方法（培养法、化学方法和实验暴毒试验）具有实验简单、较易控制，数据可重复性高、比较可靠，直接反映污染效应，耗费较低，其结果具有直接的生态相关性等优点，但其又具有滞后性、被动性、间接性、实际推广价值有限等缺点，单独的常规暴毒的量化标准已经不能满足和适应新形势下人们对环境污染研究精确性的要求，尤其是急性暴毒实验结果不能评判一些持久性环境污染物的慢性环境效应。

2 生物标志物的研究

污染物对生物体的毒性效应必然是从作用于分子水平开始的，然后逐步在细胞、器官、个体、种群、群落、生态系统各个水平上反映出来。在分子毒理学研究中，许多研究者首先从生物化学方面探索能反映污染物对生物早期的影响参数，其中，生物标志物法因为测定指标全面、准确且系统，而得到了学者的公认。

美国科学院生物标志物委员会于1987年对生物标志物进行系统论述，将生物标志物定义为个体暴露于次生物质后发生的亚致死性生物化学变化[3]，这种变化的检测结果可作为生物体暴露效应及易感性的指示物，可作为环境质量退化的早期警报，而且可以特异性地检测到环境中致癌、致畸、致突变化合物的生物可利用性。

2.1 行为标志物（behavioral markers） 行为标志物的检测可反映发生在细胞或分子水平上所产生的综合效应。通常，随着环境内某一种影响因子浓度或影响力的升高，对个体的影响最先发生变化的是生物的行为。其运动行为的变化不仅能反映环境污染物质对机体造成的代谢、神经和肌肉等组织或器官功能的毒性[4]，而且能改变生物个体的捕食、躲避敌害等生存能力，从而对生物个体乃至整个生物群落的健康与环境适应能力造成严重影响。

Johansson等[5]研究发现PFOS/PFOA具有神经毒性效应，表现为受试幼鼠的习惯性活动减少等。金美青等[6]通过多物种净水监测仪监测斑马鱼在抗生素药物和有机磷农药暴露下的行为强度变化，发现斑马鱼对环境变化的行为反应快速且敏感，随着药物浓度的增加，斑马鱼行为强度的变化符合环境压力模型。Viberg等[7]发现，哺乳动物围生期暴露于PBDEs能导致幼体的行为异常，其中对运动和认知功能的损害尤为明显；新生鼠单剂量经口暴露于不同的PBDEs同系物下，10 d后大多数动物出现自主行为紊乱，记忆力下降。Lilienthal等[8]研究表明，胚胎发育期暴露于四溴联苯醚（BDE-47）、五溴联苯醚（BDE-99）的小鼠出生后出现多动症；暴露于BDE-99还会引起性激素水平及对甜食偏好的改变。He等[9]发现十溴联苯醚（BDE-209）能导致斑马鱼仔鱼的自由泳速度随浓度升高而显著下降。目前对PBDEs的研究多集中于神经行为、认知功能、学习与记忆等神经毒性效应方面，而对PBDEs如何引起神经毒性效应的机制研究较少涉及。

行为标志物检测已采用计算机辅助生物测试系统，运动行为反应较传统的急性毒性指标快速且敏感。因此，运动行为可以作为环境污染早期预警的生物在线监测指标。行为标志物检测的另一大优点是对生物不产生损害。故污染物的行为学研究与生物信息学的有机结合得到发展。

2.2 生化标志物（biochemical markers） 生化标志物是生物体中最早可测得的污染物诱导反应，可为更高生物水平可能产生的损害提供信息。生化变化常涉及蛋白水平的变化、酶活性改变或DNA分子的变化等。污染物进入机体后，一方面在生物酶的催化作用下进行代谢转化，另一方面也导致生物本身的酶活性改变。

在环境污染物的生态毒理学研究中细胞色素P450酶和谷胱甘肽转移酶（GST）作为外源物质的主要代谢酶被视为指示环境污染物毒性效应的重要生化标志物。有研究结果表明，鱼类、贝类的P450对环境诱导的反应具有敏感性，并且有很好的剂量-效应关系。Ferrari等[10]研究发现，鲑鱼暴露于西维因后，GST活性受到抑制。Aijun等[11]采用实验室模拟条件，研究了不同剂量的BDE-209在不同时间段对鲫鱼肝脏氧化胁迫指标的影响，并对BDE-209致鱼肝脏氧化损伤的毒性机制进行了探讨。

抗氧化防御系统是生物体内重要的活性氧清除系统，过氧化氢酶（CAT）与超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）共同组成了生物体内活性氧防御系统，因此，成分的改变也可作为机体遭受氧化胁迫的早期预警生物标志物。例如，周科[12]用不同浓度BDE-47的污染沉积物暴露后，铜锈环棱螺肝胰脏的SOD和CAT活性表现出较为明显的浓度或时间依赖性效应关系。Jing等[13]将珍珠牡蛎暴露于含Pb的溶液中，经不同时间段暴露之后分析其酶活性。结果表明经Pb暴露之后牡蛎外套膜的SOD活性就被显著地诱导，随着暴露时间的延长，SOD活性诱导率渐趋下降。

许多环境毒物如PAH、芳胺、亚硝胺、霉菌毒素和农药参与形成DNA加合物，对DNA的结构和稳定性产生影响，导致DNA分子的各种损伤，包括DNA链的断裂、交联、烷化DNA加合物、PAH-DNA加合物、环化加合物等的形成。彗星实验是近年发展起来的一种快速检测哺乳动物细胞DNA损伤的实验方法。Geng等[14]用此方法通过敌敌畏、丁草胺对斑腿泛树蜡蚌红细胞DNA的损伤研究发现，DNA损伤程度随着处理组浓度的增加而增加。Marczynski等[15]研究发现工作场所空气中苯或萘浓度的增加可引起接触工人的白细胞的DNA断线率的增加。Bagchi等[16]证实萘可以诱使活性氧自由基增加,导致脂质的过氧化反应和DNA的破坏。从文献可以看出，PAH-DNA加合物是一种有效的生物标志物，与环境暴露PAH有着密切的关系。

应激蛋白又称热休克蛋白（HSP），包括HSP家族及分子伴侣，是细胞保护机制的重要部分。近年来，很多研究用其作为环境效应的生物标志物。脊椎动物金属硫蛋白（MTs）的合成可被金属、有机化合物或其他应激因素诱导，其浓度不仅可反映急性毒性、污染物长期作用的动态过程和累积情况，还可反映该动物对污染物胁迫的解毒机制与解毒容量。跳虫分子生物标志物引起人们的重视，尤其集中于对跳虫体内金属硫蛋白和应激蛋白的研究。例如，有研究发现跳虫的应激蛋白可被杀虫剂地乐酚显著诱导[17]。

传统毒理学的毒性测试研究使用的动物多、实验周期长、工作量大，表型改变、形态学指标等较为复杂，并不能揭示污染物对生物体的损害作用以及提供预警信息。所以需要一个综合的、全面性和准确性的环境监测体系来高效、准确地对污染物的生态效应进行评估，而生物标志物检测特别是在分子水平上（DNA、RNA、离子通道和酶活性等）的变化，为揭示和预测污染物对个体的早期影响和对群体以至整个生态系统的影响提供了重要信息。

3 免疫组织化学研究

免疫组织化学或称免疫细胞化学，是指利用抗原与抗体特异性结合的原理，借助于光学、荧光或电子显微镜观察其性质定位，还可以利用细胞分光光度计、图像分析仪、共聚焦显微镜等进行细胞原位定量测定，来检查细胞及组织上原位抗原或抗体成分的方法。通过把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙结合起来，在微观上原位地确定组织结构的化学成分乃至基因表达。由于其原位性、直观性和特异性的优点，被迅速扩展应用于污染物毒理学的研究上。朱爱华等[17]对洛克沙胂暴露下斑马鱼组织（鳃、肝脏、性腺）中HSP70的表达定位进行了免疫组织化学初步研究，发现HSP70在斑马鱼的鳃、肝脏、性腺3种组织中有特异性表达。Han等[18]发现将斑马鱼暴露于硫丹下，在200 ng/L的处理组中雄性的肝脏指数（HSI）明显上升，雌性的性腺指数（GSI）明显下降；10 ng/L的处理组中雄性的HSI平均值最低，而其GSI却最高。Zha等[19]用16 ng/L的17-β-乙炔基雌二醇（EE2）处理中国鲦鱼，观察到雌性中的GSI发生类似变化。黄莉等[20]运用免疫组化的方法观察小鼠妊娠子宫对四氯苯并-P-二恶英（TCDD）毒性的敏感性，发现低剂量TCDD暴露下出现的强烈生殖毒性与TCDD在小鼠子宫内的蓄积和小鼠子宫内膜细胞中细胞色素P4501A1的诱导能力有关。在运用酵母基因系统进行不同小鼠组织中TCDD含量检测时发现，脂肪中TCDD蓄积量最多，其次是肝脏、子宫和胎儿。

免疫组织化学技术具有特异性强、灵敏度高、定位准确和简便快速等优点，这是较之于其他化学方法不可替代的优越性，又能够有机地同形态、功能及代谢的研究结合起来，用以研究其他技术（如化学、生化、免疫和生理等）难以深入的领域。

4 组学技术在系统毒理学研究中的应用

近年来兴起的功能基因组学，为环境污染物的生态毒理学的研究提供了良好的契机。组学研究不仅可能发现一些与该类药物污染相关的差异表达的新基因、新蛋白，而且可对整个转录的基因进行高度动态的时空监测。其中代谢组学方法则可为污染因子胁迫下生物体代谢物含量变化与生物表型变化建立直接相关性，能系统地掌握污染物的分子致毒机制。

4.1 蛋白质组学（proteomics） 当从mRNA水平考虑和对单个蛋白质进行研究已无法满足后基因组时代的要求时，蛋白质组学应运而生。它以直接参与生命活动的蛋白质为研究目标，界定表达蛋白质过程中涉及的影响因素，已广泛融入环境科学、生态毒理学等领域。

毒理蛋白质组学是在整体的蛋白质水平上，探讨生物接触不同毒物或环境胁迫下，细胞蛋白质的存在及其活动方式（蛋白质谱）的变化，在更加贴近生命本质的层次上探讨和阐明有毒污染物及其浓度变化所致蛋白质谱改变的“指纹特征”，也可作为有效表征污染物暴露的生物标志物。

近几年，从毒理蛋白质组学角度分析污染物胁迫下生物基因表达与调控的变化成为研究热点。Silvestre等[21]应用蛋白质组学技术研究了镉对中华绒螯蟹的急慢性毒性，发现镉急性中毒时，A-微管蛋白、GST以及甲壳类钙结合蛋白等的表达下调，GST异形体表达上调。镉慢性中毒时，GST及组织蛋白D等均过量表达，ATP合成酶B和A-微管蛋白等表达下调。Shrader等[22]研究了斑马鱼胚胎暴露于雌二醇、壬基酚及不同浓度的内分泌干扰物时蛋白质谱的变化，通过蛋白质谱的差异表达说明这两种化合物的反应路径不同，致毒机制不同，作用的毒理学终点不同。徐立利等[23]结合蛋白质组学分析方法和软件，构建斑马鱼胚胎的蛋白质表达谱，分析表明在250 ppm浓度的毒死蜱胁迫下，24 hpf斑马鱼胚胎就产生19个差异蛋白质。Villeneuve等[24]利用蛋白质组学建立硬骨鱼类下丘脑-垂体-性腺轴的毒理模型，包含鱼类繁殖相关的6个主要器官，涉及调控轴上105个蛋白和40个小分子的相互作用，25个基因的转录调控。

但是，总体而言毒理蛋白质组学尚处于发展阶段，研究范围还非常有限，未来毒理蛋白质组学的发展不仅需要高通量、高灵敏度、自动化的蛋白质组学技术作技术支撑，更需要通过设计合理的实验方案、采用正确的统计学方法，使实验室内与室外的实验结果具有可比性，达到实验效益的最大化。

4.2 转录组学（transcriptomics） 实际上，污染物的毒性效应和生物应答无疑是基因表达调控协同运作的反应信号，即使我们对每个生物标志物的功能都已确定，有关致毒机制问题也不能得到很好的解答。采用新一代高通量RNA-seq测序技术并借助于生物信息学分析软件，对染毒和对照生物品系进行转录组和转录后调控差异分析，寻找隐藏在基因组内microRNA的调控网络是实现系统毒理学研究的关键，也是比较不同物种对环境污染敏感的多样性、解毒代谢途径多样性的重要手段。Linney等[25]将斑马鱼胚胎暴露于毒死蜱，利用基因芯片技术研究发现，45个基因明显上调表达，15个基因下调表达。

最近才发展起来的转录组调控网络的研究成为人们深入毒理分子机制的最有效手段，也是生物领域崭新的研究热点。microRNA 是全基因组基因表达调控网络中的一部分，它隐藏于基因组内的信息层，有学者称之为基因组内的“暗物质”，不可见却执行着新层次调控基因表达的功能。目前只有很少部分microRNA功能通过实验确定与环境胁迫应答有关，这为以全microRNA表达图谱来进行毒理分析，即毒理microRNA基因组学提供了理论依据[26]。目前，利用microRNA毒理基因组学进行毒理学分析的研究寥寥可数，而且大部分局限于单个microRNA的功能分析，还没有人从全microRNA表达谱的角度来进行研究。不过可以肯定的是，一些毒性相关的基因（如P450、p53等）的表达调控与microRNA相关[27]。

4.3 代谢组学（metabolomics） 转录组学可对整个转录的基因进行高度动态的时空监测，而代谢组学方法则可为污染因子胁迫下生物体代谢物含量变化与生物表型变化建立直接相关性。通过代谢物化学分析技术及数据分析技术综合运用使得代谢组研究在疾病诊断、药理研究以及毒理学等研究中发挥了极为重要的作用。

比较分析健康状态与疾病状态下小分子代谢物表达的差异，这有助于人们寻找各种疾病早期诊断的生物标志物，可用于疾病预后及治疗效果的评判。而在毒理学研究中，利用代谢组技术分析代谢物组分的变化可直接反映毒物胁迫对机体造成的最终影响。比如Lelliott等[28]利用磁共振与转录组技术有机结合，研究表明三苯氧胺（TMX）作用通过降低脂肪酸合成酶（FAS）的表达及活性严重影响了肝脏内脂肪代谢。梁宇杰[29]通过磁共振，统计大鼠尿液和血清的生化代谢产物谱，发现残杀威、氯菊酷及等毒性混配剂的亚慢性染毒会引起一定程度的肝毒性和肾毒性。Williams等[30]利用高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）研究D-丝氨酸给药大鼠的尿液，发现色氨酸浓度升高而其代谢物含量下降，得出丝氨酸毒性损伤与抑制色氨酸分解代谢有关，同时给予一定剂量安息香酸钠盐能抑制D-丝氨酸引起尿液代谢功能的紊乱。

与其他毒理学研究方法一样，代谢组学技术并不能解决所有问题，但能为生物学多个领域的研究提供有用信息。比如，将蛋白质组学数据与代谢组学数据进行整合，生物代谢的终点有助于验证基于蛋白质组学研究提出的假设。代谢组学研究使得代谢物含量变化与生物表型变化建立直接相关性，极大促进了后基因组学时代功能基因组研究的发展。

5 展望

当前，生态风险评价研究正朝着多重性和实际性的方向发展。在现阶段的研究中，还存在问题如下：①毒理学研究的污染物设置浓度与环境中实际残存浓度相差甚远，室内高浓度的致毒效应往往不能正确评估污染物的生态风险。实际上，环境中尤其是城市污水处理厂处理末端的痕量污染物正是环境污染的主要源头，经过污水处理厂排水后造成二次污染。虽然这些痕量的漏检物不会对生物带来直接而快速的影响，但其长期作用于生态系统可引发慢性致毒效应，恰恰对水生生物和人类健康产生隐患，也是人们最易忽视的部分，因此应加强污染物的慢性致毒机制研究，或寻找更敏感的标志物，作为野外真实环境的早期诊断及生态风险评价的指标。②多数情况下，单一化合物在环境中痕量存在使人们忽视其可能的环境效应，然而，多种药物在环境中同时存在则意味着加和或协同作用的可能性，但是在相对稳定的生境下，多种药物痕量水平的复合污染慢性毒理学效应的研究报道还较少。实际上，生态系统中往往是结构不同、作用模式不同的污染物以复合状态共同存在，依靠单一的污染物研究不足以提供全面的风险信息，要准确真实地评价其环境风险，展开不同作用模式的新型污染物痕量浓度的联合毒性效应研究，建立生态毒理学模型体系成为当务之急。③环境内多重途径的多种化合物的联合作用是一个具挑战性且有很强现实意义的课题。其联合作用会随混合物各组分组成、暴露时间、途径、次序等不同而改变，在活体实验中，化合物在生物体内的代谢转化更使研究复杂化。因此，有关环境污染物联合暴露的研究一般集中在离体（in vitro）细胞试验上，而对于动物的活体（in vivo）试验，鉴于实验操作和结果解析上的困难，研究较少。

利用微观与宏观方法相结合来评价有毒污染物的毒性将是重要的研究趋势：分子、细胞、个体、种群、群落直至整个生态系统是一个有机联系的整体，在不同结构和功能层次上阐述污染效应对生态毒理学的环境解释能力是不同的。从细胞到分子水平是毒理学微观技术发展的必然趋势，但仅从基因和蛋白质水平上研究外源性化学物的毒性及其机制是不够的。只有通过将细胞、分子水平的研究与整体、种群等各个不同层次的研究结合起来才能正确评价污染物的毒性效应。

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Q3

C

1000-2138（2012）02-0192-05

2011-11-07

浙江省自然科学基金资助项目（5100333）；浙江省科技厅公益项目（2011C23114）。

林枝（1990-），女，浙江台州人，本科生。

王慧利，博士，副教授，Email：whuili@163.com。

吴健敏）

·高教研究·