DC－CIK 细胞治疗小儿恶性肿瘤研究现状

王亚峰 综述 刘秋玲 审校

小儿恶性肿瘤无论在临床表现、组织病理类型还是治疗反应上均与成人恶性肿瘤不同，有其独特的生物学特性，如小儿癌肿潜伏期短，生长迅速，侵袭性强，多与环境的致癌因素无关，组织学上以母细胞瘤多见等［1］。近年来，随着分子生物学研究的不断深入及综合治疗方法的不断完善，肿瘤的诊治水平得到了很大提高［2］。目前，除了手术、化疗及放疗外，细胞免疫治疗已成为小儿肿瘤治疗的第4 种重要手段。树突状细胞(dendritic cell，DC)是功能强大的专职抗原提呈细胞(antigen presenting cells，APC)，可高效介导对特异性抗原的特异性免疫应答。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine－induced killer cells，CIK)是一种新型高效的免疫效应细胞，具有增殖速度快、杀伤活性高等优点。树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞(DC－CIK)共同培养后，具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性和自然杀伤细胞的非组织相容性复合物限制性杀伤特性［3］，拥有强大的增殖活性和细胞毒活性。作为新一代过继免疫细胞，DC－CIK 细胞目前已被用于多种成人肿瘤的治疗，在部分小儿恶性肿瘤的治疗中，DC－CIK 细胞也显示出其独特的疗效。笔者就DC－CIK 细胞在小儿恶性肿瘤治疗中的应用情况作一综述。

1 DC 细胞的生物学特性与抗肿瘤机制

1.1 DC 的生物学特性 1973 年Steinman 和Cohn 首次发现DC，因其表面的指状突起而称其为树突状细胞。DC 已被证明是目前发现的功能最强大的抗原提呈细胞，其抗原递呈能力较B 淋巴细胞和巨噬细胞强数百倍甚至上千倍［4］。DC可通过下列4 种方式调控、维持机体免疫反应:(1)激活静息型T 细胞诱导抗原特异性细胞毒性T 淋巴细胞的产生，是机体免疫反应的启动者和参与者;(2)直接或间接影响B 淋巴细胞的增殖、活化，参与体液免疫应答;(3)与记忆T 细胞相互作用，诱发再次免疫应答;(4)与自然杀伤细胞作用，促进机体建立非特异性、天然免疫应答等［5，6］。DC 广泛分布于除脑以外的全身各脏器，能摄取加工抗原表达高水平MHC 分子、共刺激分子、黏附分子，并分泌高水平Th1 型细胞因子IL－12，故具有很强的抗原提呈能力，可有效激发T 细胞应答。人DC 的主要特征性标志为CDla、CD83 及CD11c。DC还表达MHCⅡ类分子，辅助刺激分子CD80 及CD86，黏附分子CD40、CD44、CD54 以及β1、β2 整合素家族成员。此外，DC 还能分泌IL－1、IL－6、IL－8、IL－12、TNF－α、IFN－α等细胞因子，参与机体的免疫调节。

1.2 DC 的抗肿瘤机制 大量研究发现，DC 的抗肿瘤机制主要有［7］:(1)诱导产生大量效应T 细胞。在肿瘤患者体内，只有抗原提呈细胞捕获并加工处理呈递肿瘤抗原后，才能形成针对肿瘤抗原的特异性T 细胞克隆，从而形成有效的抗肿瘤免疫效应。针对肿瘤患者体内的免疫状况，DC 可在抗肿瘤治疗中表现出其突出的优势，如通过细胞表面高水平的MHC－I、MHC－Ⅱ类分子呈递丰富的肿瘤抗原肽作为激活抗肿瘤细胞毒性T 淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)的第一信号，同时提供高水平的B7－1、B7－2、CD40 等黏附分子作为第二信号而充分激活肿瘤特异性的CTL。(2)启动效应T 细胞迁移至肿瘤部位。DC 有别于其他抗原提呈细胞的突出特性之一是其具有较强的定向迁徙能力。有报道表明，DC 能通过分泌细胞因子和趋化因子选择性趋化T 细胞，通过血管内皮屏障而增加肿瘤部位的效应T 细胞数量。(3)保持效应T 细胞在肿瘤部位的长期存在。DC 和T 细胞之间的相互作用，以及滤泡DC 对抗原的保留都可促使DC分泌某些生存因子而促进T 细胞的生长，维持T 细胞反应。(4)抑制肿瘤血管的生成。DC 可能通过释放某些抗血管生成物质IFN－γ、IL－12 及前血管生成因子而影响肿瘤血管的形成。(5)DC 与T 细胞结合后，可以分泌大量IL－12 及IL－ 8 等细胞因子，主导CD4+Thl 型的免疫应答，有利于对肿瘤病灶的清除。

2 CIK 细胞的生物学活性与抗肿瘤机制

2.1 CIK 细胞的生物活性 CIK 细胞最初是指在健康人体外周血中的CD3+CD56+T 淋巴细胞，占1% ～5%。Schmidt－wolf 等［8］于1991 年首次发现在外周血淋巴细胞中加入IFN－γ、IL－2 和抗CD3 单克隆抗体，可培养出大量CD3+和CD56+T 细胞，兼具有T 淋巴细胞的抗肿瘤活性和NK 细胞的非MHC 限制性杀瘤活性，具有增殖速度快，杀伤活性高，抗瘤谱广等特性。通过对CIK 细胞的表面标志研究发现，CIK 细胞为CD3+CD56+细胞群，而这些CD3+CD56+CIK 细胞主要来源于CD3+CD56+的T 淋巴细胞，而非CD3+CD56+的NK 细胞。CIK 细胞的另一重要来源是CD4+CD8+T 淋巴细胞群。由于CD4+CD8+T 细胞经过1 个月的细胞因子诱导培养后，有56%的T 细胞可同时表达CD3+CD56+，说明CD4+CD8+T 细胞也是CIK 细胞的重要来源。这种双阳性T 细胞按细胞受体的不同，进一步可分为CD3+CD56+αβT 细胞及CD3+CD56+γδT 细胞两种亚群［9，10］。

2.2 CIK 细胞的抗肿瘤机制 目前关于CIK 细胞对肿瘤细胞的杀伤原理尚未完全阐明，研究表明，其可能的机制有以下几点:(1)CIK 细胞能通过黏附因子识别肿瘤细胞，通过两条途径直接杀伤靶细胞:一是CIK 细胞通过淋巴细胞功能相关抗原－1/细胞间黏附分子－1(LFA－1/ICAM－1)系统与靶细胞通过释放颗粒酶和穿孔素对靶细胞实行MHC 非限制性杀伤。另一途径为CIK 细胞表面的CD3 样受体被结合而激活CIK 细胞产生胞浆毒性颗粒介导的溶细胞作用［11］。(2)CIK 细胞活化后可分泌IL－2、TNF－α、IFN－γ、GM－CSF 等多种抗肿瘤细胞因子，提高了细胞毒作用，或调节肿瘤细胞对CIK 细胞的敏感性，发挥直接抑制作用和免疫系统介导的间接杀伤作用［12］。(3)诱导肿瘤细胞凋亡及坏死。CIK 细胞能活化肿瘤细胞凋亡基因，使得FLIP、Bcl－2、Bcl－xL、DAD1 和survivin 基因表达上调［13］。Cooper 等［14］的研究显示，培养的CIK 细胞表面表达的Fas－L (fas 配体)与相应肿瘤细胞识别结合后，可激活细胞内源性DNA 内切酶，从而起到杀瘤作用。(4)CIK 细胞回输后可以激活机体免疫系统，提高机体的免疫功能。

3 CIK 与DC 的协同抗肿瘤作用

临床研究发现部分患者进行CIK 细胞治疗时疗效不太理想，原因可能是肿瘤细胞对这些免疫效应细胞发生了抵抗，可能与肿瘤患者功能性的DC 缺乏有关［15］。因此，将CIK 细胞与DC 联合治疗恶性肿瘤，将有助于解除部分肿瘤患者T 细胞的免疫无能，从而发挥协同抗肿瘤作用。研究表明，DC 和CIK 共同培养后具有更强的肿瘤杀伤活性，体外扩增速度更快，杀瘤谱更广［16］。DC 和CIK 是肿瘤免疫治疗的两个重要部分，前者识别抗原、激活获得性免疫系统，后者通过发挥自身细胞毒性和分泌细胞因子杀伤肿瘤细胞，二者联合确保了一个高效和谐的免疫体系［17］。目前，关于DC－CIK 杀伤肿瘤细胞的机制尚不十分清楚，除上述的CIK 细胞抗肿瘤机制外，刘苗等［18，19］实验证实还可能与Foxp3 和GATA－3 基因参与了T－bet 介导的DC－CIK 细胞杀瘤途径有关，其杀瘤机制主要表现为Th1 途径活化，而Th2 途径和Treg 途径受抑制。

4 DC－CIK 细胞在小儿恶性肿瘤中的应用现状

4.1 DC－CIK 细胞在儿童白血病治疗中的应用 目前，已有少数学者运用DC－CIK 细胞治疗小儿白血病。文钦等［20］对1 例难治复发性髓细胞白血病患儿行DC－CIK 细胞治疗，DC－CIK 细胞共输注5 次，患儿均未出现不良反应。定期复查血常规、肝肾功能、巨细胞病毒指标，均在正常范围内，细胞治疗107 d 后复查骨髓示完全缓解。Liu 等［21］从白血病患儿骨髓中获得单个核细胞，并在体外培养成DC－CIK 细胞。在培养10 ～25 d 后，将DC－CIK 与白血病细胞混合培养并用MTT 法检测其杀瘤活性。结果显示:在效靶比为12.5∶1或25∶1 时，杀瘤率可达50% ～60%，提示DC－CIK 细胞对儿童白血病细胞具有强大的杀伤作用。这些研究结果将推进临床DC－CIK 细胞治疗儿童白血病的发展，尤其是对难治复发性白血病提供新的治疗方法。

4.2 DC－CIK 细胞在儿童恶性淋巴瘤治疗中的应用 恶性淋巴瘤在成人中多见，儿童恶性淋巴瘤的发病率较成人低，以非霍奇金淋巴瘤为主，预后较差。在成人恶性淋巴瘤临床治疗应用中DC－CIK 细胞疗法已取得显著效果［22－24］，在儿童淋巴瘤的临床治疗中尚未见资料报道，但已有学者进行了相关的的实验室研究。Wei 等［25］从健康志愿者外周血中培养出DC－CIK 细胞，将其培养9 d 后与Raji 淋巴瘤细胞混合培养，在一定效靶比下观察DC－CIK 细胞对淋巴瘤细胞的杀伤率。结果显示:在效靶比为40 ∶1 时杀伤率最高，达(67.18 ±4.01)%，而且杀伤率与效靶比在5∶1 至40∶1 之间呈正相关。袁利亚等［26］取昆明小鼠骨髓单个核细胞在体外诱导DC－CIK 细胞，再将小鼠EL4 淋巴瘤Pcc4 胚癌细胞株作为靶细胞，培养一段时间后与DC－CIK 细胞混合培养，用流式细胞术检测免疫表型，MTT 法测定杀伤活性。结果显示:DC－CIK 细胞共培养后，CD3+和CD3+CD8+双阳性细胞显著增多，在(5∶1)～(40∶1)的效靶比范围内，DC－CIK细胞对淋巴瘤细胞有较强的杀伤率。

4.3 DC－CIK 细胞在儿童恶性肉瘤治疗中的应用 儿童恶性肉瘤(如横纹肌肉瘤、尤文肉瘤等)发病率较低，临床治疗主要以化疗、手术加局部放疗为主。细胞免疫疗法可能会具有显著的治疗效果，但目前尚处在实验研究阶段。Kucis等［27］从6 名健康志愿者外周血中提取单个核细胞，然后培养成CIK 细胞，再将CIK 细胞分别和横纹肌肉瘤细胞株RMS13、Rh30、RH41 等在一定条件下混合培养。对CIK 表型分子、增殖速度、杀瘤率等多个指标进行观察后发现:CIK 细胞与横纹肌肉瘤细胞株混合培养后，约有50%的横纹肌肉瘤细胞被杀死，其中NKG2D 可能在杀瘤过程中起了重要作用。Michael 等［28］对尤文肉瘤细胞株进行荧光染色，传代培养后建立裸鼠模型。将含有CD3xHer2/neu 双抗体的CIK 细胞注射裸鼠并观察肿瘤生长变化。结果显示:含有CD3xHer2/neu 双抗体的CIK 细胞有强大的细胞毒作用，对肿瘤细胞有明显的抑制作用。上述研究的CIK 细胞缺少DC 的激活，杀瘤活性有待进一步增强。

4.4 DC－CIK 细胞在儿童视网膜母细胞瘤治疗中的应用视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)是儿童常见的眼内恶性肿瘤，目前主要以手术、化疗、放疗及局部治疗进行综合治疗，细胞免疫治疗因其独特的优越性有可能成为治疗RB 新的重要手段。唐松等［29］从RB 外周血中诱导扩增出成熟DC，并进一步利用RB 肿瘤抗原冲击致敏DC，激活自体T 淋巴细胞，通过不同的效靶比体外对视网膜母细胞瘤细胞株SO－RB50 进行杀伤。结果表明，DC 诱导的细胞毒性T 淋巴细胞对SO－ RB50 有较强的杀伤作用，显示出细胞免疫疗法在治疗RB 上有潜在的临床价值，但目前国内外尚无文献报道DC－CIK 细胞治疗RB 的资料。

4.5 DC－CIK 细胞在儿童神经母细胞瘤治疗中的应用 儿童神经母细胞瘤是儿童最常见的颅外神经源性实体瘤，恶性程度高，进展较快，易发生早期转移［30］，传统治疗方法疗效不理想。有研究表明:细胞因子诱导的自然杀伤细胞对神经母细胞瘤有一定的杀伤作用。Richard 等［31］把神经母细胞瘤细胞注入28 只小鼠体内，待肿瘤生长一段时间后，再向小鼠体内注射IL－2 和IL－18 诱导的自然杀伤细胞。结果显示:实验组中有57%小鼠的瘤细胞完全消失。关于DC－CIK 细胞治疗神经母细胞瘤在国内外尚未见文献报道。

5 问题与展望

目前，DC－CIK 细胞在成人肿瘤的临床治疗已经开展，但开展时间较短，数据也不丰富，需继续扩大DC－CIK 细胞治疗的临床应用范围，以获取更多的临床资料。小儿恶性肿瘤在肿瘤的发生和生物学特性方面与成人肿瘤有很大区别，且小儿的免疫系统尚未发育完全，免疫功能低下，耐受性差，所以DC－CIK 细胞免疫疗法除在小儿血液系统恶性肿瘤中有少数临床应用外，在其他小儿恶性肿瘤中均停留在实验研究阶段，国内外尚无临床试验的资料报道。另外，DC－CIK的治疗方案和疗效标准尚待进一步统一和规范。细胞治疗注射途径、不良反应和注射时间等需要进一步探讨，尤其是不良反应，虽然不似化疗药物那样具有明显的细胞毒作用，但其培养体系中不少成分也能引起一定不良反应，如IL－2、IFN－γ 可引起寒战、发热、肌痛及胃肠道反应等，需引起临床足够的重视。随着相关研究的不断深入，DC－CIK 过继免疫细胞疗法在联合放疗、化疗及手术治疗中的价值以及在肿瘤综合治疗中的地位将会得到进一步证实和肯定，从而进一步提高临床疗效，最大程度地改善肿瘤患者的生活质量。

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