组蛋白去乙酰化酶6在宫颈癌组织中的表达及其临床意义*

华方方， 夏永华， 陈瑞香， 王玉红， 潘 莹， 杨 君， 梁武风△

(新乡医学院第一附属医院1妇产科，2皮肤科，河南新乡453100;3新乡医学院第三附属医院妇产科，河南新乡453003)

宫颈癌(cervical cancer)是全球妇女最普遍的肿瘤之一，每年全球估计有470 000新病例发生和大约233 000病例死亡［1-2］。尽管大约90%以上的宫颈癌与高致癌风险的人乳头状瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染密切相关［3-4］，但单独的HPV尚不足以诱导肿瘤的恶性转化，许多其它尚未被鉴定的基因可能参与到宫颈癌的发生发展过程中［5］。因此鉴定新的基因作为宫颈癌筛查、诊断和治疗的分子标记显得十分重要。

组蛋白去乙酰化酶6(histone deacetylase 6，HDAC6)的基因定位于人染色体Xp11.23［6-7］。HDAC6是一种比较独特的组蛋白去乙酰化酶，具有2个功能性的去乙酰化结构域和1个锌指基序［8-9］。HDAC6作为一种微管蛋白去乙酰化酶能够通过去乙酰化依赖性和非依赖性的方式调控微管蛋白的解聚［10］，但是最近发现其与肿瘤的发生发展密切相关，包括乳腺癌［11］、卵巢癌［12］、口腔癌［13］、胃癌［14］和结肠癌［14］等。但是迄今为止，尚未见任何关于HDAC6在宫颈癌中的研究报道，因此在本研究中，我们利用免疫组织化学和Western blotting方法研究宫颈癌组织中HDAC6蛋白的表达，并研究其可能的临床意义，该研究旨在为以HDAC6为分子靶点的宫颈癌的诊断和治疗提供新的理论依据。

材料和方法

1 组织标本

63例宫颈癌组织、38例宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)组织和63例正常宫颈上皮组织取自新乡医学院第一附属医院2006～2009年手术切除标本，并经病理组织学检查确诊。其中随机选取4例宫颈癌组织［经病理学诊断随机选取，2例为IIa期(低分化)，1例为Ia1期(中分化)，1例为Ia2期(高分化)］和自身相对应的正常宫颈上皮组织取样后液氮保存备用，行Western blotting分析。所有患者术前均未接受任何形式的治疗，包括放疗、化疗和免疫治疗。患者年龄25～73岁，中位年龄41岁，其中≥45岁的43例，＜45岁的20例。按2000年FIGO分期:Ia期18例，Ib1期16例，Ib2期18例，IIa期11例。组织学分级:高分化15例，中分化32例，低分化16例。宫颈癌标本中有14例伴有淋巴结转移。浸润深度:≤1/2层30例，＞1/2层25例，全层8例。

2 方法

2.1 免疫组织化学 HDAC6鼠抗人单克隆抗体购自Santa Cruz，免疫组织化学SP试剂盒和DAB显色剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。免疫组织化学染色步骤参照使用说明书进行操作。HDAC6Ⅰ抗稀释浓度为1∶50。以PBS代替Ⅰ抗作为阴性对照，以已知的阳性宫颈癌切片为阳性对照。

2.2 结果评估 以细胞质出现棕黄色颗粒为阳性细胞。具体的判定方法按参考文献［15］执行，即按照细胞着色强度和阳性细胞数建立评定方法。随机计数5个高倍视野，每例标本至少评价1 000个细胞。染色强度:轻度着色，1分;中度着色，2分;强染色，3分。阳性细胞＜10% 为1分;10%≤阳性细胞＜50%为2分;50%≤阳性细胞＜80%为3分;≥80%为4分。将染色强度与阳性细胞数比率相乘得到每个病例染色的总分。总分1～3分为阴性;总分4～12分为阳性。

2.3 Western blotting 将组织从液氮中取出，研磨后，用组织蛋白裂解液提取总蛋白，然后将提取的总蛋白进行SDSPAGE电泳。电泳结束后，取下凝胶电转移到硝酸纤维素(NC)膜上。用含5%脱脂奶粉的TBST液封闭NC膜2 h，加入Ⅰ抗(HDAC6)(1∶100)，4℃ 摇床孵育过夜。加入Ⅱ抗室温孵育2 h。将NC膜置于ECL(增强化学发光试剂)中反应1～3 min，于暗室中利用X射线曝光，常规方法显影定影，显示特异的蛋白信号。蛋白表达的灰度值利用Image-Pro Plus 5.0软件进行分析，蛋白相对表达为目的基因与内参基因的比值，β-actin作为内参照。每例样品做3次实验，取平均数和标准差进行比较。

3 统计学处理

采用SPSS 13.0软件进行统计学处理。采用χ2和t检验分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 不同宫颈组织中HDAC6蛋白的表达

免疫组织化学方法检测63例宫颈癌组织、38例宫颈上皮内瘤变组织和63例正常宫颈上皮组织中HDAC6蛋白表达。结果显示，HDAC6蛋白主要定位于宫颈癌细胞的胞质中，呈浅黄色至棕黄色颗粒，见图1。HDAC6蛋白在宫颈癌组织中表达的阳性率(80.95%)显著高于宫颈上皮内瘤变组织(39.47%)和正常宫颈上皮组织(11.11%)，3组之间HDAC6蛋白的表达有显著差异(χ2=62.718，P＜0.01)，见表1。

Figure 1.Expression of HDAC6 protein in different cervical tissues(×400).A:normal cervical epithelial tissue; B: cervical intraepithelial neoplasia; C: cervical cancer tissue.图1 HDAC6蛋白在不同宫颈组织中的表达

表1 HDAC6蛋白在宫颈癌、宫颈上皮内瘤变组织和正常宫颈上皮组织中的表达Table 1 .Expression of HDAC6 protein in cervical cancer cervical intraepithelial neoplasia and normal cervical epithelial tissues

2 HDAC6蛋白的表达与临床病理学参数之间的关系

表2显示，HDAC6蛋白的表达与宫颈癌患者的年龄和组织分化程度无关(P＞0.05)，但与临床分期、浸润深度以及淋巴结转移均关系密切(P＜0.01或P＜0.05)。

表2 HDAC6蛋白表达与宫颈癌患者临床病理参数之间的关系Table 2 .Correlation between the level of HDAC6 protein and clinicopathological parameters in the patients with cervical cancer

3 Western blotting检测宫颈癌组织和正常宫颈上皮组织中HDAC6蛋白的表达

随机选取的4例宫颈癌组织中HDAC6蛋白的表达均显著高于其对应的正常宫颈上皮组织(P＜0.05)，见图2。

Figure 2.Expression of HDAC6 protein in cervical cancer tissues (T)and normal cervical epithelial tissues(N).±s.n=4.*P＜0.05 vs N.图2 HDAC6蛋白在宫颈癌组织和正常宫颈上皮组织中的表达

讨论

肿瘤的发生发展与组蛋白的乙酰化和去乙酰化之间关系密切。组蛋白乙酰化能够诱导染色质松弛和基因的转录，而去乙酰化能够使得染色质凝集和转录停滞。组蛋白的乙酰化通过组蛋白乙酰转移酶在特定的赖氨酸残基上实现，组蛋白去乙酰化酶催化逆向反应。HDAC6是一种独特的组蛋白去乙酰化酶，既能牵涉到组蛋白的去乙酰化［6］，也能影响细胞质非组蛋白的功能［16］，因而得以广泛研究，大多数研究主要涉及其与肿瘤发生发展的关系。

研究发现，HDAC6高表达已经在许多其它人的肿瘤和鼠的肿瘤模型中被鉴定。HDAC6在卵巢癌细胞和组织中的表达水平显著高于良性组织和卵巢正常上皮细胞［12］。Sakuma等［13］的研究发现，HDAC6在原发性的口腔鳞癌细胞系中表达上调，其表达水平与原发性的肿瘤分期密切相关。此外，在原发性的急性髓细胞样白血病母细胞瘤和成髓细胞系中HDAC6表达上调。HDAC6在多种不同的肿瘤组织和细胞系中表达上调表明其在肿瘤的发生发展中发挥重要作用，但尚未见关于HDAC6在宫颈癌中的研究报道，因此在本研究中，我们分析63例宫颈癌组织、38例宫颈上皮内瘤变组织和63例正常宫颈上皮组织中 HDAC6蛋白表达。结果显示，HDAC6蛋白在宫颈癌组织、宫颈上皮内瘤变组织和正常宫颈上皮组织中表达的阳性率分别为 80.95%、39.47%和11.11%，3组之间HDAC6蛋白的表达具有显著差异(P＜0.05)，提示宫颈癌中高表达的HDAC6可能与宫颈癌的发生发展密切相关，这一结果与HDAC6在其它肿瘤中的表达具有明显的一致性［17-18］。进一步我们发现HDAC6蛋白的表达与宫颈癌患者的年龄和组织分化程度无关(P＞0.05)，但与临床分期、浸润深度以及淋巴结转移均关系密切(P＜0.01或P＜0.05)。利用免疫组织化学了解HDAC6蛋白的表达和定位后，我们采用更为灵敏的Western blotting进一步证实宫颈癌组织中HDAC6蛋白的表达情况。我们发现，宫颈癌组织中HDAC6蛋白的表达均显著高于其相对应的正常宫颈上皮组织，其差异具有统计学意义(P＜0.05)。更为重要的是，我们在采用Western blotting检测3号样品正常宫颈上皮组织时未发现HDAC6蛋白的表达，这一结果从某种程度上来说进一步验证了免疫组织化学结果的可靠性。

总之，我们的研究表明，宫颈癌组织中存在高水平的HDAC6，其高表达与肿瘤的临床分期、浸润深度以及淋巴结转移有关，但是其相关的分子机制尚需进一步探讨，进一步的研究有望为以HDAC6为靶点的宫颈癌基因治疗提供新的理论依据。

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