模拟酸雨胁迫下钙离子对高羊茅种子发芽的影响

常青山，张利霞，万 涛，王庆亚，王 瑞

(1.河南科技大学林学院，河南 洛阳471003; 2.河南科技大学农学院，河南 洛阳 471003; 3.景德镇高等专科学校生化系，江西 景德镇 333000; 4.南京农业大学生命科学学院，江苏 南京 210095；5.南京农业大学园艺学院，江苏 南京 210095)

酸雨是当今世界面临的重大环境污染因素之一[1]。中国是目前世界上继欧洲和北美之后出现的第三大酸雨覆盖区域，境内受污染的地区约占国土总面积的40%。酸雨成为目前中国面临的极其严峻的环境污染问题之一[2-3]。酸雨能使人类赖以生存的生态环境发生重大改变，使土壤酸化、盐基离子流失，导致作物根系发育严重受阻、活力显著下降，并影响其对营养物质的吸收与利用，从而直接或间接地对作物的生长及产量产生不良影响[2,4-5]。一般来说，植物种子在萌发与幼苗阶段极易受到酸雨胁迫的不良影响[6-7]。因此，许多缓解酸雨胁迫的相关研究均在植物种子萌发与幼苗期展开[8-9]。大量研究表明，外源钙处理可以降低细胞膜透性、稳定细胞膜、提高抗氧化酶活性、减轻胁迫造成的氧化伤害[10-11]，可以缓解重金属胁迫[12]、盐胁迫[13-14]、酸雨胁迫等各种胁迫伤害[8]。

然而，外源钙对不同胁迫缓解作用的研究多集中在农作物[12,15]与经济作物上[16-17]，在草坪草中研究相对较少。随着长江中下游地区城市化进程的加快，人们对城市园林绿化与生态环境的改善有了越来越高的追求，而酸雨却成为影响城市绿化，特别是影响草坪绿化的一个重要因素[18]。因此，研究草坪草及其相关生态技术，有效缓解酸雨胁迫带来的伤害，对酸雨地区城市生态环境保护与防治具有重要意义。高羊茅(Festucaarundinacea)作为一种绿期较长的冷季型草坪草，广泛用于城市园林绿化、运动场草坪的建植和公路护坡等生态建设工程中，在长江中下游地区城市绿化中也有着大面积的应用[19]。本研究以高羊茅种子为材料，研究不同浓度CaCl2溶液浸种对模拟酸雨胁迫下高羊茅种子萌发特性的影响，以期为长江中下游酸雨地区高羊茅草坪建植提供理论与实践依据。

1 材料与方法

1.1材料 高羊茅种子购自江苏省农业科学研究院，从美国进口，室内袋装贮藏，品种为金质克拉多。

1.2模拟酸雨的配制 根据江苏省实测降水中SO42-与NO3-的摩尔浓度之比 (约5∶1)[20]，参照曹春信等[21]的方法制备模拟酸雨：配制0.25 mol·L-1H2SO4和0.05 mol·L-1HNO3溶液，按等体积比配制模拟酸雨的酸母液；配制浓度高于天然酸雨成分1 000倍的电解质母液，含3.1 g·L-1CaC12、8 g·L-1NH4Cl、0.91 g·L-1NaCl和0.75 g·L-1KCl。然后将电解质母液稀释1 000倍后，用酸母液调节模拟酸雨的pH值为2.5。

1.3方法 利用RXZ-300D人工智能气候箱(宁波江南仪器制造厂)进行种子发芽试验。培养条件：温度(25±1) ℃，每天光照12 h，相对湿度80%。准确称取无水CaCl2，以去离子水配制成0(以无CaCl2的去离子水作对照)、5、10、25、50、100 mmol·L-1的 CaCl2溶液。选取籽粒饱满、大小基本一致的高羊茅种子，用0.5%的双氧水溶液消毒30 min，再经去离子水漂洗3次并用吸水纸吸干表面水分，然后在上述配好的各种浓度CaCl2溶液及去离子水(对照)中浸泡24 h后，用去离子水漂洗种子3次，吸水纸吸干种子表面的水分。将浸种处理过的种子放入预先铺上2层滤纸的培养皿中，每皿50粒，4个重复，保持间距尽量一致。每个培养皿加入15 mL pH值2.5的模拟酸雨溶液进行胁迫试验。每2 d换一次模拟酸雨溶液，每天打开2次，与外界换气5 min，每24 h观察记录发芽情况；最后一天记录最终发芽数及幼苗鲜质量、苗高与根长。本试验采用国家标准[22]规定的高羊茅末次计数时间(第14天)，从第1天开始每天统计发芽的种子数，14 d后计算以下相关指标[23-24]：

1)发芽率(GR)=(n/N)×100%(n为最终达到的正常发芽粒数，N为供试种子数)；

2)发芽势(GP)=(n5/N)×100%(n5为种子发芽第5天的正常发芽粒数，N为供试种子数)；

3)发芽指数(GI)=∑(Gt/Dt)(Gt为在t天的发芽数，Dt为相应的发芽天数)；

4)活力指数=GI×S(GI为发芽指数，S为单株鲜质量)；

5)鲜质量、苗高和根长：随机抽取10株，计算高羊茅幼苗鲜质量单株平均值，以及苗高与根长单株平均值。

1.4质膜透性测定与计算 测量发芽第14天的正常幼苗电导率，并以相对电导率来反映幼苗的膜透性[25]。参考韩永华等[26]的方法测定幼苗电导率：从对照及不同处理中分别称取生长一致的鲜苗0.1 g，剪成长度为0.5 cm的小段，3个重复。用去离子水充分冲洗干净后，用吸水纸吸干水分，置于20 mL试管中，并加10 mL去离子水，摇匀、密封，室温放置24 h，用DDB-6200型数字电导仪测定电导率E1；然后置沸水浴中煮30 min，冷却后测定电导率E2；同时测定其背景电导值E0。按下式计算电导率(P)：

P=(E1-E0)/(E2-E0)×100%.

1.5统计分析 数据采用SPSS 13.0进行方差分析与多重比较(Duncan新复极差法)，然后采用Origin 8.0作图。不同CaCl2处理对酸雨胁迫下高羊茅种子发芽的影响采用主成分分析与隶属函数法进行评价[27]。

隶属函数值计算公式:

(1)

反隶属函数值计算公式:

(2)

式中，Xj为第j个综合指标，Xmin、Xmax分别为第j个综合指标的最小值和最大值。若所测指标与抗性指标正相关则采用公式(1)，反之采用公式(2)。最后用各指标的隶属函数值乘以相应的权重系数(权重系数为负值时取绝对值)来计算综合评定值。

2 结果与分析

2.1模拟酸雨胁迫下高羊茅种子的发芽率和发芽势 在模拟酸雨胁迫条件下，经过CaCl2浸种的高羊茅种子的发芽率与发芽势呈现先增加后降低的趋势(图1A、图1B)。各处理均高于对照，其中25～100 mmol·L-1CaCl2处理与对照差异显著(P<0.05)。随着CaCl2溶液浓度的升高，在50 mmol·L-1CaCl2溶液浸种处理下高羊茅发芽率与发芽势达到最大，100 mmol·L-1CaCl2溶液处理开始下降，但仍高于对照。在25 mmol·L-1CaCl2溶液浸种下，高羊茅的发芽率与发芽势分别比对照增加了12.41%和41.10%；在50 mmol·L-1CaCl2溶液浸种下，高羊茅的发芽率与发芽势分别比对照增加了21.82%和58.40%。

2.2CaCl2溶液浸种对高羊茅种子发芽指数与活力指数的影响 不同浓度的CaCl2处理对模拟酸雨胁迫下的高羊茅种子的发芽指数与活力指数影响明显，均高于对照；随着CaCl2溶液浓度的升高，二者均呈先上升后下降的趋势(图1C、图1D)。25和50 mmol·L-1CaCl2溶液处理下发芽指数显著高于对照(P<0.05)，分别比对照增加了23.37%和31.98%。10～100 mmol·L-1CaCl2溶液处理下的高羊茅种子活力指数均显著高于对照，其中25和50 mmol·L-1CaCl2溶液处理下的活力指数分别比对照提高了61.86%和76.10%。

图1 CaCl2溶液浸种对模拟酸雨胁迫下高羊茅种子发芽率(A)、发芽势(B)、发芽指数(C)和活力指数(D)的影响Fig.1 Effects of seed soaking in CaCl2 solution on germination rate (A), germination energy (B), germination index (C) and vigor index (D) of Festuca arundinacea seeds under simulated acid rain stress

2.3CaCl2溶液浸种对模拟酸雨胁迫下高羊茅幼苗生长的影响 不同浓度下CaCl2溶液浸种处理对模拟酸雨胁迫下高羊茅种子幼苗苗高的影响明显，均显著高于对照(P<0.05)，25和50 mmol·L-1CaCl2处理幼苗苗高与对照相比分别增加了49.08%和56.35%，但二者差异不显著(图2A、图2B)。从根长来看，除5 mmol·L-1外，其他CaCl2浓度处理下的根长均显著高于对照，25和50 mmol·L-1CaCl2处理的根长与对照相比分别增加了10.10和6.96倍。从增加的幅度来看，CaCl2浸种处理对根长的影响高于对苗高的影响。

各处理下的幼苗鲜质量均高于对照，除5 mmol·L-1CaCl2处理外，其他处理均与对照差异显著(P<0.05)(图2 C)。随着处理浓度的增加，幼苗鲜质量先增加，然后在100 mmol·L-1CaCl2处理下降低。25和50 mmol·L-1CaCl2处理可以显著提高高羊茅种子在模拟酸雨胁迫下的鲜质量，其鲜质量分别比对照增加了34.82%和37.20%，但这两个处理之间差异不显著。

2.4不同浓度CaCl2浸种处理对模拟酸雨胁迫下高羊茅幼苗质膜相对透性的影响 不同浓度CaCl2溶液处理下，高羊茅幼苗的电导率均显著低于对照(P<0.05)(图2D)。在5～25 mmol·L-1CaCl2浓度范围，电导率随CaCl2处理浓度升高而降低，在25 mmol·L-1CaCl2溶液处理下，其电导率达到最低值。在50和100 mmol·L-1CaCl2处理下，高羊茅幼苗的电导率随CaCl2浓度增加而升高，幼苗的细胞膜透性增加。25和50 mmol·L-1CaCl2处理的电导率与对照相比分别减少44.36%与32.39%。

图2 CaCl2溶液浸种对模拟酸雨胁迫下高羊茅幼苗苗高 (A)、根长 (B)、鲜质量 (C)和电导率(D)的影响Fig.2 Effects of seed soaking in CaCl2 solution on seedling height (A), root length (B), fresh weight (C) and electrical conductivity (D) of Festuca arundinacea seedlings under simulated acid rain stress

2.5不同浓度CaCl2浸种处理对模拟酸雨胁迫下高羊茅种子萌发的综合评定 主成分分析表明，第1主成分中，发芽率等发芽指标对应的相关系数分别为0.920、0.959、0.984、0.996、0.983、0.907、0.985和-0.913，特征根为7.319，累积贡献率为91.49%。根据主成分的累积方差贡献率大于80%～85%的原则[28]，选留第1主成分。发芽指数、活力指数、苗高在此成分上有较高载荷，说明钙溶液浸种处理对模拟酸雨胁迫下的高羊茅这3个指标的影响很大。提取这一主成分基本上可以反映全部指标的信息，因此，应用这一综合变量来代替原来的8个变量。通过计算，获得主成分表达式：

F1=0.340x1+0.354x2+0.364x3+0.368x4+0.363x5+0.335x6+0.364x7-0.337x8。

式中，x代表主成分表达式中的主成分变量,x1为发芽率，x2为发芽势；x3为发芽指数，x4为活力指数，x5为苗高，x6为根长，x7为鲜质量，x8为电导率。

根据主成分表达式各指标权重值的大小可以看出各指标在钙浸种对模拟酸雨胁迫下种子发芽特性影响大小的重要性，由大到小依次为发芽指数、活力指数、苗质量、鲜质量、发芽势、根长、发芽率、电导率。根据主成分表达式计算出各钙溶液浸种处理的得分，5种浓度CaCl2溶液浸种处理影响耐酸雨胁迫的能力由强到弱依次为50、25、10、100、5、0 mmol·L-1(表1)。

表1 CaCl2浸种对模拟酸雨胁迫下高羊茅种子发芽特性的影响能力得分Table 1 The scores of effects of seed soaking in CaCl2 solution on germination characteristics of Festuca arundinacea seeds under simulated acid rain stress

为避免单一指标的片面性并克服多个指标的复杂性，全面而准确地评价CaCl2溶液浸种处理对高羊茅种子发芽特性及幼苗生长状况的影响，本研究采用隶属函数法对不同浓度CaCl2溶液浸种处理对模拟酸雨胁迫的影响进行评定，确定不同CaCl2溶液浸种处理对模拟酸雨胁迫的影响大小。依据各指标的隶属函数值，结合主成分分析中各指标的权重值进行综合评定，综合评定值越大，表明钙溶液浸种对高羊茅在模拟酸雨胁迫下发芽能力的提高作用愈明显。由表2可知，5种钙溶液浸种处理对酸雨胁迫下高羊茅种子发芽能力的影响由强到弱的顺序依次为50、25、10、100、5、0 mmol·L-1。两种方法分析结果的一致性说明了本研究结果科学可靠。

表2 CaCl2浸种对模拟酸雨胁迫下的高羊茅发芽各指标影响的隶属函数分析Table 2 Subordinate function analysis of effects of seed soaking in CaCl2 solution on indices of seeds germination of Festuca arundinacea under simulated acid rain stress

3 讨论

3.1钙溶液浸种处理可以提高对模拟酸雨胁迫下的高羊茅种子发芽的数量与品质 钙是植物的必需元素之一，在细胞伸长、分裂以及细胞膜构成、渗透性等方面具有重要作用，已有大量研究证明其可以有效提高种子的活力[10,17,29]。与对照相比，适宜的钙溶液浸种不仅显著提高种子的发芽势、活力指数及幼苗的苗高、根长、鲜质量，而且降低了幼苗的电导率，说明钙溶液浸种在提高种子发芽率的同时，种子的品质与活力也得以大幅度提高，这与前人的相关研究结果一致[8,30]。钙溶液浸种可以提高模拟酸雨胁迫下高羊茅种子的发芽能力，一方面在于钙溶液可以缓解模拟酸雨本身的酸度[31]，另一方面在于钙可以激活H+-ATP酶增强植物对细胞质pH值的调节，同时激活部分保护酶活性，从而减轻模拟酸雨胁迫对细胞膜结构的破坏，增强细胞抗酸胁迫的能力[16,32-34]。

3.2钙溶液浸种处理对模拟酸雨胁迫下高羊茅种子的发芽特性相关指标的影响作用不同 钙处理对模拟酸雨胁迫下高羊茅发芽的各指标中的幼苗根长影响作用最大，50 mmol·L-1CaCl2溶液浸种处理的根长是对照的7.96倍，其次为活力指数，50 mmol·L-1CaCl2溶液浸种处理的活力指数比对照提高76.10%，该处理下的发芽势与苗高分别比对照提高58.40%和56.35%，仅对发芽率的影响在各指标中最小，比对照提高21.82%。模拟酸雨胁迫显著抑制草坪草根系的生长，对根长的影响要显著大于对幼苗苗高的影响[35]，而钙溶液浸种处理则可显著减少模拟酸雨胁迫对幼苗苗高与根长的影响，对根长的影响作用显著大于对幼苗苗高的影响作用。原因可能在于随着钙对模拟酸雨胁迫的缓解，幼苗胚根所受胁迫减轻，高羊茅种子的胚根生长速度快于胚芽，因而钙处理表现对高羊茅根长的影响较大。在钙处理对盐胁迫下的高羊茅种子萌发影响的研究中，高浓度钙处理对高羊茅种子萌发产生伤害，其处理效果甚至低于对照[30]。而在本研究中，高浓度处理虽然效果较差，但仍高于对照，原因可能在于钙处理对酸雨胁迫的缓解效果好于对盐胁迫的缓解效果。

3.3模拟酸雨胁迫下高羊茅种子发芽随钙处理浓度增大具有先促进后抑制的特点 钙能参与膜结构的保持与修复，稳定膜脂及膜蛋白的结构，维持植物细胞内离子的平衡，保持细胞结构与功能的完整，使植物维持正常的生理活动[15,17]。添加适量的钙，可以维持钙信号系统的正常发生与传递，加强质膜的稳定性，并进一步维持细胞内离子的平衡。从本研究结果也可以看出，适宜浓度的钙溶液浸种有效降低幼苗的电导率，减少植物体内细胞膜的损伤。而在50和100 mmol·L-1CaCl2处理下电导率则开始升高，相对增加了膜透性，原因可能在于较高浓度的钙处理可能超过植物的吸收能力使植物造成渗透胁迫，导致细胞内的离子平衡被打破，形成类似盐害的破坏作用从而增加膜透性[30]。

综合分析认为，钙溶液浸种可有效提高模拟酸雨胁迫下高羊茅种子的发芽能力，随着CaCl2处理浓度的增加，高羊茅在模拟酸雨胁迫下种子发芽能力逐渐提高，但超过一定浓度后反而使高羊茅种子的发芽能力降低。其中以50 mmol·L-1CaCl2处理对模拟酸雨胁迫下的高羊茅种子发芽作用最好，本研究对于长江中下游酸雨地区高羊茅草坪建植具有一定的指导意义，至于应用于其他草坪草种是否有明显的缓解效果则有待于进一步验证。

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