新牧1号苜蓿两个抗逆相关基因启动子的克隆及分析

杨云尧，任燕萍，苏豫梅，陈全家，张 博，张 桦

(1．新疆农业大学农业生物技术重点实验室 新疆农业大学农学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2．新疆草地资源与生态重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830052)

从抗逆性较强的新牧1号苜蓿(MedicagovariaXinmu-1)中成功克隆得到了两个抗逆相关基因MvNHX1(NCBI登录号：EU375310)和MvDREB1(NCBI登录号：GU073286)。Na+/H+逆向转运蛋白合成基因(NHX)会在外界环境的Na+浓度提高时，合成Na+/H+逆向转运蛋白，然后将Na+转运到液泡中，实现区隔化，从而减少细胞质中的Na+浓度[1-2]；DREB1蛋白是植物体内一种非常重要的转录因子，它可诱导一系列非生物逆境相关基因表达，研究表明，转DREB1基因可以改良转基因植株逆境耐受性[3-4]。但是，在植物基因工程中，外源基因上游大量使用的是组成型启动子，如CaMV35S启动子，组成型启动子调控的下游基因表达没有时空的特异性，在植物的任何生长发育阶段和组织中都正常表达，这会造成细胞代谢负荷而影响植物的长势和产量。目前，因为一些诱导型启动子可以有效地调控下游基因的表达，如rd29A启动子，所以能够更好地降低转基因植物体内积累的外源蛋白对其自身造成的伤害。Kasuga等[5]将rd29A：：DREB1A和35S：：DREB1A转入烟草(Nicotianatabacum)后，与非转基因烟草植株相比，转35S：：DREB1A基因烟草的生长情况明显滞后；但是转rd29A：：DREB1A基因烟草植株的抗逆性明显增强。Pellegrineschi等[6]用胁迫诱导型启动子rd29A驱动DREB1A/CBF3的表达，使转基因小麦(Triticumaestivum)的抗旱性得到提高，并且没有出现明显的畸形。至今能够用于转基因研究的诱导型启动子仍然不多。所以，对于新的抗逆相关启动子的克隆、各元件与转录因子之间相互作用以及顺式作用元件具体序列的确定的研究是非常重要的。因此，对两种类型的抗逆相关基因MvNHX1和MvDREB1启动子进行克隆并分析，可有助于研究抗逆基因表达调控的分子机制，也可进一步利用MvNHX1和MvDREB1基因启动子驱动抗逆基因在转基因植物中进行表达。这对于了解植物的抗逆机制和提高作物的抗逆性有重要的意义。

1 材料与方法

1.1植物材料 试验中所用新牧1号苜蓿是由新疆农业大学草地资源与生态重点实验室提供。

1.2主要试剂 Plant Genomic DNA Kit、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、DH5α感受态细胞和DNA Marker购自天根生化科技有限公司，引物由华大基因合成，pMD19-T载体试剂盒、TRNzol总RNA提取试剂、SYBR Premix Ex TaqTM和染色体步移试剂盒等购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3试验方法 根据新疆农业大学农业生物技术重点实验室已克隆的两个基因：新牧1号苜蓿Na+/H+逆向转运蛋白基因(MvNHX1)和DREB1转录因子基因(MvDREB1)的基因序列，分别设计引物(表1)。

表1 启动子克隆及荧光定量PCR中所用引物序列Table 1 Primers used for real-time PCR and promoter cloning

1.3.1实时荧光定量分析MvNHX1和MvDREB1基因在盐胁迫下的表达情况 用150 mmol·L-1NaCl对新牧1号苜蓿幼苗进行胁迫后，分别在0、1、3、6、12和24 h采取叶片样品并提取总RNA，利用紫外分光光度法测得各胁迫时间的总RNA浓度以定量总RNA，且分别反转录得到cDNA，最后根据在GenBank中已登录的苜蓿微管蛋白基因(EU664318)为内参，按TAKARA荧光定量试剂盒说明书所述进行Real-time PCR。采用相对定量2-△△Ct法计算MvNHX1和MvDREB1基因在盐胁迫下的表达量[7]。

1.3.2MvNHX1和MvDREB1基因启动子的克隆 新牧1号苜蓿发芽10 d后，用天根植物基因组DNA提取试剂盒方法提取新牧1号苜蓿总DNA。用设计好的两对引物按照Geneme walking kit说明书各进行3次巢式PCR[8-9]。

第1轮PCR反应：PCR扩增体系为基因组DNA 1 μg，dNTP(mixture,2.5 mmol·L-1each)8 μL，10×LA PCR Buffer 5 μL，LA Taq酶(5 U·μL-1)0.5 μL，P1 Primer 1 μL，AP1 Primer 1 μL，加去离子水补足50 μL。PCR程序为94 ℃ 1 min，98 ℃ 1 min；运行94 ℃变性30 s，65 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循环5次；然后进行步骤1：94 ℃ 30 s，25 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min；步骤2：94 ℃变性30 s，65 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min；步骤3：94 ℃变性30 s，65 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min；步骤4：94 ℃ 30 s，44 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，4个步骤共循环15次；最后72 ℃ 10 min。

第2轮PCR反应：PCR扩增体系为0.01×第1次PCR反应液1 μL，dNTP(mixture，2.5 mmol·L-1each)8 μL，10×LA PCR Buffer 5 μL，P2 Primer 1 μL，AP1 Primer 1 μL，LA Taq酶(5 U·μL-1)0.5 μL，加去离子水补足50 μL。PCR程序为第1轮PCR反应的步骤2～4，3个步骤共循环15次；最后72 ℃ 10 min。

第3轮PCR反应：PCR扩增体系为0.01×第2次PCR反应液1 μL，dNTP(mixture， 2.5 mmol·L-1each)8 μL，10×LA PCR Buffer 5 μL， P3 Primer 1 μL，AP1 Primer 1 μL，LA Taq酶(5 U·μL-1)0.5 μL，加去离子水补足50 μL。PCR程序同第2轮PCR反应。

琼脂糖电泳检测后回收目的条带，回收及后续的连接、转化及酶切验证的具体步骤参照试剂盒说明书。筛选两个基因启动子的阳性克隆送华大基因测序[10-11]。

2 结果与分析

2.1MvNHX1和MvDREB1基因在盐胁迫下的表达情况 在盐胁迫0、1、3、6、12、24 h后，MvNHX1基因的平均相对表达量分别为2.17%、4.05%、12.15%、9.68%、32.07%和47.33%(图1)。这说明MvNHX1基因的表达量在盐胁迫后均上调，但在6 h时表达量有所降低。荧光定量PCR结果表明，在前6 h，MvNHX1的表达量上升并不明显，但6 h后，MvNHX1表达上升极为明显。胁迫24 h后的表达量是胁迫前的21.8倍，这说明MvNHX1受盐胁迫诱导后上调表达幅度较大。而MvDREB1基因在不同时间盐胁迫后，相对表达量均维持较低水平，基本在1%以下，0与24 h的相对表达均在0.3%左右，这表明MvDREB1基因表达量在盐胁迫前后基本没有变化。

图1 MvNHX1基因和MvDREB1基因在不同胁迫时间的表达Fig.1 Expression of MvNHX1 and MvDREB1 genes in different stress time

2.2新牧1号苜蓿抗逆相关基因启动子的克隆 用设计好的两对引物对新牧1号苜蓿的基因组DNA进行3轮PCR后，分别选取两组第3轮PCR结果(图2)中最亮的条带即第3泳道的1 500 bp左右大小的条带和第6泳道位于750 bp左右大小的条带进行回收。

图2 MvNHX1、MvDREB1启动子的3次PCR结果Fig.2 Three times’ PCR results of promoters of MvNHX1 and MvDREB1

将回收得到的两条带分别按pMD19-T载体试剂盒说明书和DH5α感受态细胞操作说明书进行连接、转化，筛选阳性克隆送华大基因测序[12]。

2.3MvNHX1和MvDREB1基因启动子的序列分析 综合利用plantCARE(http:// bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)和PLACE(http:// www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalup.html)两个启动子在线分析软件对测序成功的两条启动子序列进行分析[13]。

MvDREB1启动子克隆得到的片段经在线综合分析后(图3)发现，MvDREB1启动子序列位于该基因转录起始位点的上游，大小为778 bp,属于RNA聚合酶Ⅱ型启动子，片段中含有6个TATA序列保守区；含有4个GATA框；含有7个CAAT框等通用启动子元件，并且还含有5个MYC元件(参与低温和脱水反应，是与低温调节有关的转录因子 ICE1等的识别位点[14])。

MvNHX1启动子克隆得到的片段经综合分析后(图4)发现，MvNHX1启动子序列位于该基因转录起始位点上游，全长1 655 bp，MvNHX1启动子含有17个CAAT框、4个TATA框核心启动子元件、1个MYC元件和6个GATA框等植物启动子中存在的通用启动子元件，属于RNA聚合酶Ⅱ型启动子。而且，还含有2个富含TC的重复区作为逆境反应的应答元件，4个G框作为光调控的作用元件等。

3 讨论与结论

由荧光定量结果可知，随着盐胁迫时间的延长，MvNHX1基因的相对表达量总体上呈上升趋势，且自6 h后，其相对表达量上升更加明显。当盐胁迫时间为6 h时，其相对表达量与3 h的相比虽有所下降，但相比协迫前表达上调。产生这一现象的原因可能是由于6 h是新牧1号苜蓿MvNHX1基因耐盐应答机制的调整阶段，也可能是由品种自身的耐盐差异性引起的[15]。DREB转录因子作为AP2/EREBP转录因子家族的重要成员之一，也具有这个家族特点，就是家族成员都存在一个保守的DNA结合区——AP2/EREBP区。其中EREBP亚家族主要是调节植物对高盐、干旱、低温、病原及激素等的分子应答反应。EREBP亚家族中的DREB类转录因子可激活一系列的抗逆功能基因的表达，提高植株的抗逆性[16]，在植物抗逆过程中起到重要作用。新牧一号杂花苜蓿MvDREB1基因与MvNHX1基因相比在盐胁迫后上调表达并不明显，相对表达量都很低，表明该基因与苜蓿的耐盐性并不相关，而后续的启动子序列分析结果也显示MvDREB1基因在盐胁迫表达顺式作用元件的数量上也比MvNHX1基因少很多。

图3 MvDREB1启动子序列和结构Fig.3 The sequence and structure of MvDREB1 promoter

本研究的克隆和分析结果表明，MvNHX1和MvDREB1基因启动子均属于RNA聚合酶Ⅱ型启动子，都具有真核生物典型的核心启动子区，含有GATA框、CAAT框和TATA框等通用启动子元件，而且也都含有逆境反应的应答元件和光调控的作用元件等各种转录调控相关的顺式作用元件。

MvNHX1和MvDREB1基因启动子序列分析表明：MvNHX1基因启动子比MvDREB1基因启动子多出10个CAAT框，由于CAAT框是一种很强的热诱导表达启动子中的顺式作用元件，能够与HSE(heat shock response element)或STREs(stress response elements)等其他热诱导启动子中的顺式作用元件共同作用诱导产生一些能够在高温下保护植物的热激蛋白，所以相对于MvDREB1启动子，MvNHX1启动子更可能会在高温时诱导下游基因表达；而MvDREB1启动子中MYC元件的数量比MvNHX1启动子要高出4个，MYC是与低温调节有关的转录因子ICE1等的识别位点，所以MYC的大量存在能更多的在低温下诱导基因的表达，因此MvDREB1基因启动子相对MvNHX1启动子可能使下游基因在低温条件下更好的表达；同时两种基因启动子中都含有的DRE(TACCGCACAT，脱水响应元件)、G框、TC重复区等水分诱导顺式作用元件，这些顺式作用元件的存在使得这两种启动子在干旱、脱水的环境下都可能会启动各自的基因表达；但是在盐胁迫下的荧光定量PCR分析表明，MvNHX1在盐胁迫后表达上调，而MvDREB1在盐胁迫后仍为低水平表达，说明这两个基因的启动子响应盐胁迫的元件有区别，这可能也与MvNHX1启动子中CAAT框元件和MvDREB1启动子中MYC元件有关，因为本研究是在室温下进行的，可能由于温度较高使得在高盐的情况下MvNHX1启动子较MvDREB1启动子更容易启动基因表达。由于光、温度、水分等环境因素影响植物生长发育和农作物产量，各种因素对植物的影响不是孤立的，在一定程度上是相互联系的，如低温和高温会造成植物生理脱水，所以，MvNHX1可能在高温、干旱、高盐时调控下游基因表达，MvDREB1启动子可能在低温、干旱时调控下游基因的表达。所以这两种基因启动子中各种作用元件之间的相互协同使得植物中同一基因启动子可以对多种环境胁迫产生响应，诱导基因表达，提高植物对环境的适应能力[17-18]。

图4 MvNHX1启动子序列和结构Fig.4 The sequence and structure of MvNHX1 promoter

研究基因转录调控机制进而构建基因表达调控网络的关键在于基因启动子区转录调控元件的识别，生物信息学方法是解决该类问题的重要手段之一。本研究采用“保守区段中转录调控元件扫描”和“基因启动子区保守区段的识别”相结合的方法进行调控元件发掘，相比使用在线相关软件(PLACE、PlantCARE等)对单条基因启动子区进行调控元件的识别，可能会缺失对部分转录调控元件的识别结果，但是在一定程度上却能增加识别结果的准确性，从而为揭示基因的转录调控机制提供更可靠的支撑。但生物信息学分析也存在一定误差。因此，要准确分析MvDREB1和MvNHX1基因启动子的功能，需要进一步验证，如可以通过构建克隆到的新启动子植物表达载体取代细胞中原有的启动子，转入后，通过检测细胞对各种胁迫的反应，才能确定此启动子的类型以及受什么因素的诱导等。

本研究已克隆得到新牧1号苜蓿两个抗逆基因MvNHX1和MvDREB1的启动子序列，并通过荧光定量PCR和生物信息学方法分析了两个基因启动子的类型和结构等，但没有对这两个基因的转录调控元件进行分析，它们是通过什么机制来调控基因表达的还有待于进一步研究。本研究为进一步揭示MvNHX1和MvDREB1基因的表达调控机制以及后续的转入受体植物中研究其是否能驱动抗逆基因进行表达从而提高作物抗逆性提供了必要的前期基础。

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