外源激素对紫穗狼尾草愈伤组织诱导及分化的影响

张晓莹，张瀚俪，牟 彤，龚束芳

(1.东北农业大学园艺学院，黑龙江 哈尔滨 150030； 2.国家广电总局2024台，黑龙江 佳木斯 154007)

由于独特的形态和生态特点，观赏草在丰富园林植物景观中的作用越来越受到人们的重视[1-3]。紫穗狼尾草(Pennisetumalopecuroides)花序独特、株型柔美、生性强健、适应性强，具有极高的观赏价值和经济价值，应用前景广阔[4-5]。哈尔滨地区园林植物景观中类似于紫穗狼尾草这种抗逆性强、低养护成本的植物资源匮乏，引种栽培紫穗狼尾草可以丰富该地区园林植物资源、创造独特的园林植物景观。引种结果表明[5]，紫穗狼尾草能够露地越冬，为确保其快速繁殖及推广应用，进而对紫穗狼尾草的植株再生进行相关研究，明确外源激素对其植株再生的影响是十分必要的。本试验对紫穗狼尾草愈伤组织诱导及分化的激素种类及浓度配比进行筛选，旨为建立紫穗狼尾草的植株再生体系提供依据，也为今后导入抗寒等目的基因、体细胞无性系变异的筛选等抗性育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1试验材料 紫穗狼尾草由东北农业大学园林系实验中心提供，于2008年4月从“北京草业与环境研究发展中心”引种栽培。

1.2试验方法

1.2.1无菌外植体培养 选取成熟饱满的紫穗狼尾草种子，剥去种子外包片，蒸馏水洗净。在超净工作台中用75%的酒精浸泡40 s，无菌水冲洗3～4次，再用3%次氯酸钠对外植体分别消毒5.0 min，无菌水冲洗3～4次，无菌滤纸吸干后接种于MS培养基。培养一周后，选择无污染的种子为试验材料，待无菌种子萌发后，以带种子的幼芽为外植体，进行愈伤组织诱导。

1.2.2愈伤组织的诱导 2,4-D对狼尾草愈伤组织诱导的影响：将外植体接种于愈伤组织诱导培养基中。以MS为基本培养基，添加不同质量浓度的生长素2,4-D(0，1.0，2.0，3.0,4.0,5.0，6.0 mg·L-1)，每个处理接种50个外植体，进行暗培养。每7 d观察一次，15 d继代培养一次，第30天统计出愈个数，并计算愈伤组织诱导率。

2,4-D、NAA、KT激素组合对愈伤组织诱导的影响：将外植体接种于愈伤组织诱导培养基上。以MS为基本培养基，添加不同浓度的激素2,4-D、NAA、KT(表1)，采用3因素3水平的L9(34)正交设计。每个处理接种50个外植体，进行暗培养。每7 d观察一次，15 d继代培养一次，第30天统计出愈个数，并计算愈伤组织诱导率。

表1 2,4-D、NAA、KT因素水平

2,4-D、KT、6-BA激素组合对愈伤组织诱导的影响：将外植体接种于愈伤组织诱导培养基上。以MS为基本培养基，添加不同质量浓度的植物生长调节剂2,4-D、KT、6-BA(表2)，采用3因素3水平的L9(34)正交设计。每个处理接种50个，进行暗培养。每7 d观察一次，第30天统计出愈个数，并计算愈伤组织诱导率。

表2 2,4-D、KT、6-BA因素水平

1.2.3愈伤组织的分化 选用长势良好的狼尾草愈伤组织为试验材料进行愈伤组织的分化研究。根据控制根或芽分化的激素模式——生长素/细胞分裂素模型，以MS为基本培养基，添加不同浓度的NAA、6-BA、KT(表3)，采用3因素3水平的L9(34)正交设计。每个处理各接种30个愈伤组织，置于光照条件下进行培养，温度为(25±1) ℃。每7 d观察一次，每15 d继代培养一次，第30天统计结果。

1.2.4数据统计与分析

表3 NAA、6-BA、KT因素水平

采用Excel软件对原始数据进行整理，采用极差分析法和方差分析法对愈伤组织诱导率和愈伤组织分化率等数据进行分析，k、R参数分别表示均值和极差[7]。

2 结果与分析

2.1植物生长调节剂对狼尾草愈伤组织诱导的影响 将外植体接种到各诱导培养基中(图1-Ⅰ)，7 d左右周围出现少量白色半透明的愈伤组织(图1-Ⅱ)，15 d左右愈伤组织膨大(图1-Ⅲ)，生长较快。为保证愈伤组织旺盛的生活力，诱导出的愈伤组织每15 d继代一次，第30天统计愈伤组织数并计算诱导率。

2.1.1不同浓度2,4-D对狼尾草愈伤组织诱导的影响 未添加2,4-D的MS培养基(B1)中，幼芽周围没有愈伤组织形成，均干枯死亡(表4)。添加2,4-D的MS培养基，均可诱导出愈伤组织，说明2,4-D对愈伤组织的形成具有促进作用。但是不同浓度的2,4-D对愈伤组织的诱导能力存在明显差异。2,4-D质量浓度为1.0～3.0 mg·L-1时诱导率逐渐提高，为3.0～4.0 mg·L-1时诱导率逐渐下降。由此可见，在一定范围内适当提高2,4-D的浓度有利于愈伤组织的诱导，浓度过高则起到抑制作用。

2.1.2NAA、2,4-D和KT激素组合对狼尾草愈伤组织诱导的影响 愈伤组织诱导率效果最好的激素组合为C5培养基，诱导率为84%(表5)。而当激素配比为C9培养基时，愈伤组织诱导率最低，为24%。对正交试验结果进行分析，各因素的极差由大至小顺序为RA(46.667)>RB(8.667)>RC(8.000)，说明各因素对愈伤组织诱导率的作用大小为2,4-D>NAA>KT。NAA与KT的作用相近，且均以较低浓。度为宜，其浓度保持在0.5～1.0 mg·L-1对于因素A，k2(78.667)>k1(53.333)>k3(32.000)，说明不同质量浓度的2,4-D对狼尾草愈伤组织诱导的能力由强到弱的顺序为3.0>1.0>5.0 mg·L-1。对于因素B，k2(60.000)>k3(52.667)>k1(51.333)，说明不同浓度的NAA对狼尾草愈伤组织诱导的能力由强到弱的顺序为1.0>2.0>0.5 mg·L-1。对于因素C，k3(59.333)>k2(53.333)>k1(51.333)，说明不同质量浓度KT对狼尾草愈伤组织诱导的能力由强到弱的顺序为1.0>0.5>0.1 mg·L-1。

图1 狼尾草诱导愈伤组织的过程

表4 不同质量浓度2,4-D对愈伤组织诱导的影响

比较各因素的k值，最大的k值分别是因素A的k2(78.667)，因素B的k2(60.000)，因素C的k3(59.333)，因此理论上9种诱导培养基中最佳试验组合为MS+2,4-D 3.0 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+KT 1.0 mg·L-1。该诱导培养基中外源激素的种类及浓度配比与C5培养基相同。

2.1.3KT、2,4-D和6-BA激素组合对愈伤组织诱导的影响 愈伤组织诱导率最高为74%，其激素组合为D6培养基，D7培养基时，愈伤组织诱导率最低，为24%(表6)。正交试验结果表明，各因素的极差，由大至小顺序为RA(33.333)>RB(14.000)>RC(2.667)，说明各因素对愈伤组织诱导率的作用大小为2,4-D>KT>6-BA。

综上可知，2,4-D对紫穗狼尾草愈伤组织的诱导作用最强，NAA和KT的诱导作用相对较弱，6-BA的作用最弱。因此，最适合紫穗狼尾草愈伤组织诱导的培养基为MS+2,4-D 3.0 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+KT 1.0 mg·L-1。

2.2植物生长调节剂对狼尾草愈伤组织分化的影响

2.2.1NAA与6-BA组合对狼尾草愈伤组织分化的影响 将紫穗狼尾草的愈伤组织转接到各分化培养基，15 d后愈伤组织表面开始出现绿色芽点(图2-Ⅰ)，30 d左右分化出不定芽(图2-Ⅱ)。

不同质量浓度的NAA和6-BA配合使用时，狼尾草愈伤组织均出现不同程度的分化(表7)。愈伤组织分化培养基E7的分化率最高，为60%。培养基E3和E6的分化率均较低，且伴有褐化现象(图2-Ⅲ)。

2.2.2NAA、6-BA、KT组合对狼尾草愈伤组织分化的影响 各激素组合的培养基中F3的分化率最高，为56.7%(表8)。分析各因素的极差，由大至小的顺序为RA(15.567)>RB(12.233)>RC(4.433)，说明各因素对愈伤组织分化率的作用大小为NAA>6-BA>KT浓度。NAA对愈伤组织分化的作用较明显，以0.5～1.0 mg·L-1与3.0 mg·L-16-BA配合效果最佳。

表5 愈伤组织诱导中 2,4-D、NAA、KT配组的正交试验L9(34)结果

表6 愈伤组织诱导中2,4-D、KT、6-BA配组的正交试验L9(34)结果

低浓度NAA和高浓度6-BA有利于愈伤组织的分化，分化率可达60%，NAA、6-BA和KT配合使用时，愈伤组织分化率最高达56.7%，可见KT对愈伤组织的分化无显著影响。综合以上研究，最适合紫穗狼尾草的愈伤组织分化培养基为MS+NAA 0.5 mg·L-1+6-BA 3.0 mg·L-1。

图2 狼尾草愈伤组织分化结果

表7 愈伤组织分化中NAA与6-BA组合的正交试验L9(34)结果

3 讨论与结论

狼尾草的离体培养及植株再生是切实可行的[8]，关于建立狼尾草再生体系的研究中，先后出现了以狼尾草幼穗[9]、茎节和顶芽[8]为外植体诱导愈伤组织，然后分化成植株的报道，但污染率高、诱导率及分化率低等问题普遍存在。本试验采用成熟种子预先培养外植体的方法[10]，其操作简单、成功率高。在此过程中植物生长调节物质在组织培养的过程中也担任重要的角色。培养基中添加的外源激素组合及浓度直接影响体细胞愈伤组织的诱导及分化。

本研究采用正交设计和方差分析，通过对影响紫穗狼尾草外植体愈伤组织诱导及分化的外源激素进行分析，初步找出了主要影响愈伤诱导及分化的激素组合,使得紫穗狼尾草愈伤组织诱导率和分化率均有所提高。如在NAA、2,4-D和KT激素配比中愈伤组织诱导率最高可达84%，在NAA和6-BA激素配比中最高分化率可达60%，高于缪珊和范继红[11]的研究结果(44%)。在不同植物激素种类配比中，2,4-D对愈伤组织诱导具有决定性作用，在缺乏2,4-D的培养基中不能产生愈伤组织。生长素NAA和KT的作用相近，均以0.5～1.0 mg·L-1的浓度范围对愈伤组织的诱导起促进作用，过低则作用不明显，而过高又会抑制愈伤组织的形成。在愈伤组织分化中NAA的作用显著，且以较低浓度(0.5～1.0 mg·L-1)与较高浓度(3.0 mg·L-1)6-BA配合使用时效果最佳，NAA达到2.0 mg·L-1时就会有褐化现象发生。KT对于愈伤组织分化的作用不明显，从节约成本的角度可以少用甚至可以不用。

表8 愈伤组织分化中NAA、6-BA、KT配组的正交试验L9(34)结果Tab.8 The results of L9(34)orthogonal test for NAA combined with 6-BA and KT on callus differentiation

本研究探讨了不同外源激素对狼尾草愈伤组织诱导及分化的影响，优化了狼尾草植株再生体系，为利用分子育种等方法改良紫穗狼尾草的农艺学性状奠定基础。

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