结直肠癌组织中PI3KCB蛋白表达及其与多药耐药基因产物的相关性

高向前，吴淑华，纪 洪，李扬扬，燕 伟，孟 晓

(滨州医学院，山东滨州256603)

对于结直肠癌，目前除手术治疗外，化学药物治疗依然是重要的治疗途径，因此，选择有效的化疗药物成为本病治疗的关键。PIK3CB基因编码的蛋白为PI3KCB蛋白。Benistant等［1］研究发现，在细胞培养中野生型PI3KCB蛋白过表达可以诱导细胞转化，且在不同的肿瘤中PI3KCB蛋白表达增加也有所不同。倪丽等［2］研究发现，在体外细胞培养中抑制PI3KPI3KCB蛋白的表达，结肠癌HCT116细胞的增殖速度明显降低。本研究采用免疫组化法检测结直肠癌组织中的PI3KCB蛋白及多药耐药(MDR)基因产物LRP、GST-π、TopoⅡ，观察其表达变化，并分析二者的关系。为结直肠癌的预后判断及化疗药物的选择提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2009年1月～2010年12月滨州医学院附属医院收治的结直肠癌患者128例，男61例，女67例;年龄25～81岁。本组均为腺癌，其中高分化43例、中分化55例、低分化30例，有淋巴结转移47例、无淋巴结转移81例，TNM分期Ⅰ～Ⅱ期81例、Ⅲ～Ⅳ期47例。所有病例为首次发现结直肠癌，术前未行放、化疗。本组患者行手术治疗的过程中留取癌组织，同时取10例正常大肠黏膜组织作对照。

1.2 PI3KCB蛋白及LRP、GST-π、TopoⅡ的检测采用免疫组化SP法。鼠抗人PI3KCB蛋白单克隆抗体浓缩液购自Abcam公司。鼠抗人LRP、GST-π、TopoⅡ单克隆抗体及通用型二抗和其他辅助试剂购自福州迈新生物技术有限公司。所有标本用10%甲醛固定，常规石蜡包埋，3 μm厚连续切片。常规脱蜡后用3%的H2O2阻断内源性过氧化酶活性，柠檬酸高压抗原修复，继之分别加入1∶250鼠抗人PI3KCB蛋白单克隆抗体和鼠抗人 LRP、GST-π、TopoⅡ单克隆抗体，4℃过夜，逐步滴加通用型二抗，DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，封固。以PBS代替一抗作空白对照，用已知PI3KCB蛋白阳性的扁桃体组织切片及LRP、GST-π、TopoⅡ阳性的乳腺癌组织切片作阳性对照。以细胞质或核内出现黄色颗粒为阳性标志，PI3KCB蛋白、LRP、GST-π表达于细胞质，TopoⅡ表达于细胞核。每张切片光镜下(400×)观察10个视野，每个视野计数100个细胞，共计1 000个细胞，阳性细胞数≤25%为1分、26%～50%为2分、51%～75%为3分、＞75%为4分;细胞质或核无色为0分、淡黄色为1分、棕黄色为2分、棕褐色为3分。上述两分值的乘积≥4判为阳性，＜4判为阴性［3］。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。组间率的比较用分割 χ2检验，相关关系的分析用Spearman相关分析法。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌组织中PI3KCB蛋白的表达 10例正常大肠黏膜组织中 PI3KCB蛋白阳性 1例(10%)、阴性9例，结直肠癌组织中PI3KCB蛋白阳性105例(82%)、阴性23例，两种组织的PI3KCB蛋白阳性表达率相比，P＜0.01。低分化、中分化、高分化结直肠癌组织中PI3KCB蛋白呈阳性和阴性表达者分别为30例(100%)和0例、46例(85%)和 9例、29例(67%)和14例，低、中、高分化结直肠癌组织中PI3KCB蛋白的阳性表达率相比，P均＜0.01。47例有淋巴结转移的结直肠癌组织中，PI3KCB蛋白阳性43例、阴性4例，81例无淋巴结转移者，阳性63例、阴性18例，两者相比，P＜0.01。81例Ⅰ～Ⅱ期结直肠癌组织中PI3KCB蛋白阳性63例、阴性18例，47例Ⅲ～Ⅳ期者中阳性43例、阴性4例，两者相比，P＜0.01。65例结肠癌组织中，PI3KCB蛋白阳性60例、阴性5例，63例直肠癌组织中阳性48例、阴性15例，两者相比，P＜0.05。

2.2 结直肠癌组织中PI3KCB蛋白表达与MDR基因产物表达的相关性 128例结直肠癌组织中GST-π阳性120例(93.75%)、阴性8例，TopoⅡ阳性68例(53.13%)、阴性60例，LRP阳性106例(82.81%)、阴性 22例。PI3KCB蛋白的表达与GST-π的表达成正相关(rs=0.207，P＜0.05); PI3KCB蛋白的表达与LRP、TopoⅡ的表达无明显相关性(rs分别为0.497、0.303，P均＞0.05)。详见表1。

表1 结直肠癌组织中PI3KCB蛋白的表达与MDR基因产物表达的相关性(例)

3 讨论

PI3KCB蛋白的分子量为110～120 kD，其编码基因PI3KCB位于染色体3q22.3上。Ciraolo等［4］研究发现，PI3KCB蛋白表达缺失可导致小鼠生长阻滞以及轻度的胰岛素抵抗。提示PI3KCB蛋白正常表达能维持人体的生理代谢平衡和促进细胞生长发育。研究［5，6］表明，PI3KCB蛋白参与了体内多种信号转导途径，通过其磷脂激酶活性作用于其下游信号分子如AKT等，进而在细胞的增殖、周期调控和凋亡等活动中发挥重要作用。An等［7］研究发现，HEC-1B型子宫内膜癌细胞的PI3KCB蛋白呈过度表达，利用siRNA干扰PI3KCB蛋白的表达，能够抑制该细胞的增殖并促进其凋亡。本研究结果显示，PI3KCB蛋白在结直肠癌组织中的阳性表达率明显高于正常大肠黏膜组织，随肿瘤分化程度的降低PI3KCB蛋白的表达逐渐增强，在低分化腺癌组织中PI3KCB蛋白的阳性表达率为100%。表明结直肠癌组织中PI3KCB蛋白呈异常表达，并与肿瘤的分化程度密切相关，其可能在结直肠癌的发生以及去分化中发挥作用。PI3KCB蛋白的表达与结直肠癌的发生部位、肿瘤浸润深度、TNM分期以及是否有淋巴结转移有关，提示PI3KCB蛋白的过度表达与结直肠癌的生物学行为密切相关。

目前，结直肠癌的治疗仍以手术治疗为主，辅以化疗、放疗。肿瘤细胞对化疗药物所产生的MDR成为临床治疗中的一大难题。肿瘤的MDR是指某种化疗药物作用于肿瘤后，肿瘤细胞不仅对该种药物产生耐药，而且对未接触过的、结构和机制均不同的多种抗肿瘤药物也产生交叉耐药。因此，临床常联合检测多个MDR基因产物，以期能更客观地反应肿瘤细胞对化疗药物的耐药性。MDR标志物LRP、GST-π、TopoⅡ可以间接反映肿瘤组织中MDR的情况［8］。本研究发现，结直肠癌组织中GST-π的阳性表达率为93.75%、TopoⅡ的阳性表达率为53.13%、LRP阳性表达率为82.81%，提示结直肠癌中存在MDR现象［9］。MDR的产生与多种机制有关，如多种糖蛋白介导的药物外排泵机制、酶介导的耐药机制以及凋亡调控基因介导的耐药和信号转导通路异常等。PI3K/Akt信号转导通路的激活是肿瘤细胞对化疗药物产生MDR的关键点之一［10］。作为 PI3K/Akt细胞信号通路的重要调控分子，PI3KCB蛋白是PI3K催化亚基p110的重要组成部分。本研究结果显示，结直肠癌组织中PI3KCB蛋白的表达与MDR基因产物GST-π的表达呈正相关，而与LRP、TopoⅡ的表达无相关性，提示PI3KCB蛋白表达高的结直肠癌可能对与MDR基因产物GST-π相关的烷化剂、铂类、丝裂霉素等抗癌药物产生耐药。

综上所述，PI3KCB蛋白在结直肠癌组织中呈高表达，与结直肠癌的发生及其生物学行为有关。同时，PI3KCB蛋白的表达与MDR基因产物GST-π的表达呈正相关。因此，检测PI3KCB蛋白的表达对于判断结直肠癌的生物学行为、预后以及合理筛选有效的化疗药物具有重要参考价值。

［1］Benistant C，Chapuis H，Roche S，et al.A specific function for phosphatidylinositol 3-kinase alpha(p85alpha-p110alpha)in cell survival and for phosphatidylinositol 3-kinase beta(p85alphap110beta)in de novo DNA synthesis of human colon carcinoma cells［J］.Oncogene，2000，19(44):5083-5090.

［2］倪丽，宋于刚.RNA干扰靶向抑制PIK3CB基因表达对结肠癌HCT116细胞增殖和凋亡的影响［J］.肿瘤，2011，31(1):22-27.

［3］宋庆平，王晓东.非小细胞肺癌组织中survivin、Cyclin B1的表达变化及意义［J］.山东医药，2010，50(2):79-80.

［4］Ciraolo E，Iezzi M，Marengo S，et al.Phosphoinositide3-Kinase p110β activity:key role in metabolism and mammary gland cancer but not development［J］.Sci Signal，2008，1(36):1-11.

［5］夏曙，于世英.PI3K/Akt信号转导通路在恶性肿瘤中的研究进展［J］.肿瘤，2006，26(6):576-579.

［6］Velho S，Oliveira C，Ferreira A，et al.The prevalence of PIK3CA mutations in gastric and colon cancer［J］.Eur J Cancer，2005，41 (11):1649-1654.

［7］An HJ，Cho NH，Yang HS，et al.Targeted RNA interference of Phoinositide 3-kinases p110-β induce apoptosis and proliferation arrest in endometrial carcinoma cells［J］.Pathology，2007，212 (2):161-169.

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