“采用双末端大规模平行测序对孕妇尿液中的胎儿DNA 的高分辨率分析”点评

郑枫芸

（复旦大学生物医学研究院，上海 200032）

1 论文题目及原文摘要

1.1 论文题目

High Resolution Size Analysis of Fetal DNA in the Urine of Pregnant Women by Paired-End Massively Parallel Sequencing

1.2 摘要

BackgroundFetal DNA in maternal urine，if present，would be a valuable source of fetal genetic material for noninvasive prenatal diagnosis.However，the existence of fetal DNA in maternal urine has remained controversial.The issue is due to the lack of appropriate technology to robustly detect the potentially highly degraded fetal DNA in maternal urine.

MethodologyWe have used massively parallel paired-end sequencing to investigate cell-free DNA molecules in maternal urine.Catheterized urine samples were collected from seven pregnant women during the third trimester of pregnancies. We detected fetal DNA by identifying sequenced reads that contained fetal-specific alleles of the single nucleotide polymorphisms.The sizes of individual urinary DNA fragments were deduced from the alignment positions of the paired reads. We measured the fractional fetal DNA concentration as well as the size distributions of fetal and maternal DNA in maternal urine.

Principal FindingsCell-free fetal DNA was detected in five of the seven maternal urine samples， with the fractional fetal DNA concentrations ranged from 1.92% to 4.73%.Fetal DNA became undetectable in maternal urine after delivery.The total urinary cell-free DNA molecules were less intact when compared with plasma DNA.Urinary fetal DNA fragments were very short，and the most dominant fetal sequences were between 29bp and 45bp in length.

ConclusionsWith the use of massively parallel sequencing，we have confirmed the existence of transrenal fetal DNA in maternal urine，and have shown that urinary fetal DNA was heavily degraded.

2 论文核心内容及点评

传统产前分子遗传诊断主要采用侵入性取样方法，如绒毛膜取样、羊膜腔穿刺等，可能造成自然流产、胎儿损伤、羊水持续渗漏感染及栓塞等严重后果，非侵入性产前诊断是临床运用的新方向。

香港中文大学的卢煜明教授是非侵入性产前诊断技术的首创者。早在1997年，他率先发现孕妇外周血中存在游离的胎儿DNA，2010年开发出一种新的非侵入性检测技术，即通过母亲的血液样本获得胎儿的全基因组图谱。他们采用双末端大规模平行测序技术（paired-end massively parallel sequencing）对血浆DNA 分子进行测序，通过比对寻找匹配的胎儿DNA 序列。

大规模平行测序技术 （massively parallel sequencing，MPS）是基于Sanger测序的高通量基因测序新技术，是目前三大主要的二代测序技术之一。构建末端配对测序（paired-end sequencing）的DNA 文库，为基因组进一步拼接提供定位信息。此技术因高准确性、高灵敏度及运行成本相对较低等优势，被越来越多地应用于基因组学研究中。

今年，卢煜明教授的研究团队又运用MPS 在另一种临床上重要的体液—孕妇尿液中检测游离的胎儿DNA。本研究结果发表在2012 年10 月的《Science Translational Medicine》上，第一作者是

Nancy Bo Yin Tsui。

孕妇的尿液中如果存在胎儿DNA，那么将成为非常宝贵的无创产前诊断资源。然而，胎儿DNA是否存在孕妇尿液中一直存在争议。问题或许在于目前缺乏恰当的技术手段检测存在于母亲尿液中，可能大部分已降解的胎儿DNA。

尿液中的游离DNA 主要有2个来源：尿道细胞降解的DNA和血浆透过肾脏滤过屏障排泄到尿液中的DNA。血浆中的胎儿DNA 在母体分娩后被迅速清除，半衰期为16分钟，一种可能的机制是血浆中的胎儿DNA穿越肾脏屏障排泄到母亲的尿液中。作者基于此假设，采用MPS来精确测量母体尿液中胎儿DNA 分子的片段大小、浓度的高分辨率谱。

他们分别收集了孕妇在分娩前用导尿管收集的尿液和自然排泄的尿液，并以1例男性和1例非孕女性的尿液为对照，通过实时荧光定量PCR 检测Leptin基因DNA 片段（LEP）的浓度，发现自然排泄的尿液中游离胎儿DNA 的浓度显著高于导尿管收集的尿液（图1）。

图1 导尿管收集的尿液和自然排泄的尿液中LEP 基因DNA 片段的浓度比较

接着，作者通过特异的单核苷酸多态（SNP）等位基因序列来识别胎儿的DNA。主要原理是根据母亲为纯合子（AA）基因型而胎儿为杂合子（AB）的SNP进行确定。计算胎儿特异的等位基因（B 等位基因）和与母体共享等位基因（A 等位基因）的数目，通过公式获得胎儿DNA 占孕妇尿液的百分数。7个尿样中共检测到5个样本中含胎儿游离DNA，浓度范围在1.92%～4.73%，分娩后的产妇尿中检测不到胎儿游离DNA。

研究者还测量了胎儿和母体DNA 在尿液中的大小分布。他们将匹配序列与人基因组参考序列（hg18）进行位置比对，推导每例尿液中的DNA 片段大小。尿液中胎儿游离DNA 分子的总体完整性低于血浆中的游离DNA（图2），这些DNA 片段一般很短，大部分长度在29～45bp之间。

图2 孕妇血浆与尿液DNA 片段分布比较

虽然与血浆相比，孕妇尿液中胎儿DNA 片段更短，浓度和检出率（71%）偏低，并且此研究局限于妊娠晚期，但这种摸索性的大胆尝试，为产前诊断的方法学研究领域开拓了新思路。如果今后能扩大样本量，进行规模性、系统性的研究，则将能为临床提供有意义的数据。相信在未来几年，随着先进的技术手段的运用，检测胎儿DNA 进行非侵入性产前诊断将在临床上有更广泛的应用。