不同产地对九节菖蒲中总皂苷、齐墩果酸及腺苷含量的影响＊

白吉庆，王小平，盛 艳，李双俊

(1.陕西中医学院，陕西 咸阳 712046; 2.陕西省洛南县科学技术局，陕西 商洛 726100)

九节菖蒲为毛茛科植物阿尔泰银莲花 Anemone altaica Fisch.ext C.A.Mey.的干燥根茎，又名节菖蒲、小菖蒲、京玄参、菊形双瓶梅等，具有开窍化痰、醒脾安神功效，主要用于热病神昏、癫痫、神经官能症、耳鸣耳[1]，主产于河南、山西、陕西、甘肃和内蒙古等地[2－3]。九节菖蒲在《药物出产辨》和《中国药物标本图影》中均被视为石菖蒲的伪品，而在1963年版和1977年版《中国药典(一部)》以及《中药材手册》《中药大辞典》《中药志》等均以正品收载[3]。九节菖蒲主要含有琥珀酸、棕榈酸、5－羟基－4－氧化戊酸、β－谷甾醇、银莲花素(白头翁素)、蔗糖、皂苷[4－6]等。笔者建立了九节菖蒲中总皂苷、腺苷和齐墩果酸的含量测定方法，为其质量标准研究奠定基础。

1 仪器与试药

UV－2100型紫外－可见分光光度计(上海天美科学仪器有限公司);日立L－2400型高效液相色谱仪(UV检测器、L－2130泵、EZStant色谱工作站);Sartorius电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司，精度0.01mg);SB－3200D型超声仪(上海新芝生物技术研究所)等。齐墩果酸对照品(批号为110709－200304)、腺苷对照品(批号为110879－200202)，均由中国药品生物制品检定所提供;九节菖蒲经鉴定为毛茛科银莲花属植物阿尔泰银莲花 Anemone altaica Fisch.ext C.A.May.的根茎，流动相所用乙腈为色谱纯，甲醇、乙醇等均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

齐墩果酸:色谱柱为 Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相为乙腈－水(92 ∶8);流速为 1.0 mL/min;检测波长为208 nm;柱温为室温;进样量为10 μL。腺苷:色谱柱为Diamonsil C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相为乙腈－水(8 ∶92);流速为1.0 mL/min;检测波长为260 nm;柱温为室温;进样量为10 μL。

2.2 溶液制备

精密称取干燥至恒重的腺苷对照品适量，加甲醇使溶解，制成每1 mL含腺苷0.034 mg的腺苷对照品溶液。精密称取干燥至恒重的齐墩果酸对照品适量，加流动相使溶解，制成每1 mL含齐墩果酸0.045 mg的齐墩果酸对照品溶液。取九节菖蒲粉末1 g，精密称定，置100 mL烧瓶中，加100 mL 95%乙醇，回流1 h，过滤，滤液水浴挥干，残渣用甲醇溶液，置5 mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀，即得供试品溶液A(用于腺苷、齐墩果酸含量测定)。取九节菖蒲粉末0.5 g，精密称定，置100 mL烧瓶中，加40 mL 95%乙醇，回流1 h，过滤，滤液置50 mL容量瓶中，加95%乙醇至刻度，摇匀，精密吸取适量，置10 mL量瓶中，加95%乙醇至刻度，摇匀，即得供试品溶液B(用于总皂苷含量测定)。

2.3 方法学考察

线性关系考察[7]:精密称取齐墩果酸对照品适量，加95%乙醇制成每 1 mL 含 2 mg 的溶液。精密吸取该溶液 0，0.8，1.6，2.4，3.2，4 mL，置具塞试管中，依次加入新配制的80 g/L香兰素乙醇溶液0.5 mL，体积分数为72%的硫酸溶液5 mL，摇匀，于90℃恒温水浴上加热10 min，立即取出并于冰水浴中冷却15 min，取出，冷却至室温。以相应试剂为空白，在530 nm波长处测定吸光度，以吸光度对质量浓度线性回归。精密吸取腺苷对照品溶液1.25，2.50，3.75，5.00，6.25 mL，分别置 10 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，各取10 μL注入液相色谱仪，按2.1项下色谱条件进行测定，记录峰面积，以峰面积对质量浓度线性回归。精密吸取齐墩果酸对照品溶液 1.0，2.5，5.0，7.5，10.0 mL，分别置于10 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，各取10 μL注入液相色谱仪，按2.1项下色谱条件进行测定，记录峰面积，以峰面积对质量浓度线性回归。得回归方程 Y总=8.735 7 X+0.000 6(R2=0.999 3，Y腺=2e+08X+15 544(R2=0.999 9)，Y齐=2e+08X－19 604(R2=0.999 9)。

精密度试验:精密吸取齐墩果酸(2 g/L)对照品溶液，依法测定其吸光度，连续测定5次，其吸光度的 SR为1.4%。分别精密吸取齐墩果酸(0.045 g/L)、腺苷(0.034 g/L)对照品溶液 10 μL，按上述色谱条件进行测定，连续进样5次。结果齐墩果酸、腺苷峰面积的 RSD分别为0.4%和0.5%，表明仪器精密度良好。

稳定性试验:取同一供试品溶液，依法测定总皂苷含量，分别在 0，0.5，1，3，5 h 不同时间点进行检测，其吸光度的 SR为1.7%，表明供试品溶液在5 h内稳定。取同一供试品溶液10 μL，分别在 0，1，2，6，12 h注入液相色谱仪，测定腺苷的峰面积值，其含量的 RSD为0.6%，表明供试品溶液12 h内稳定性良好。取同一供试品溶液 10 μL，分别在 0，1，2，5，10 h 注入液相色谱仪，测定齐墩果酸的峰面积值，其含量的 RSD为0.7%，表明供试品溶液在10 h内稳定性良好。

重现性试验:取同一样品5份，依法制备供试品溶液，分别测定其吸光度，测定齐墩果酸、腺苷的峰面积值，其含量的 RSD分别为1.6%，0.4%，1.6%，表明本试验方法重现性良好。

加样回收试验:精密称取已知总皂苷含量的样品6份，精密加入一定量齐墩果酸对照品，依法测定其吸光度;精密称取已知腺苷含量的样品6份，精密加入一定量腺苷对照品，依法制备供试品溶液，取10 μL注入液相色谱仪，测定腺苷的峰面积值;精密称取已知齐墩果酸含量的样品6份，精密加入一定量齐墩果酸对照品，依法制备供试品溶液，取10 μL注入液相色谱仪，测定齐墩果酸的峰面积值，计算其回收率。结果见表1。

2.4 样品含量测定

取九节菖蒲样品，按2.2项下方法制备供试品溶液，显色后，依法在530 nm波长处测定吸光度，按2.1项下的色谱条件测定，记录腺苷、齐墩果酸的峰面积，代入标准曲线方程，计算总皂苷、腺苷、齐墩果酸的含量。结果见表2。

表1 加样回收试验结果(n=6)

表2 样品含量测定结果(n=3)

3 讨论

取适量对照品溶液和供试品溶液，置具塞试管中，依次加入新配制的80 g/L香兰素乙醇溶液0.5 mL，体积分数为72%的硫酸溶液5 mL，摇匀，于90℃恒温水浴上加热10 min，立即取出并于冰水浴中冷却15 min，取出，冷却至室温。在400～700 nm波长范围内进行扫描。结果在530 nm波长处有最大吸收，故选取530 nm波长为测定波长。取适量对照品和供试品溶液，在200～400 nm波长范围内进行扫描，结果齐墩果酸在208 nm波长处有最大吸收，腺苷在260 nm波长处有最大吸收，故分别以此作为其检测波长。通过对多种流动相的组成、检测波长、柱温进行分析比较，发现采用2.1项下的色谱条件能使色谱图的基线平直、峰形较好，且待测成分的分离度均大于1.5。

本研究中建立了九节菖蒲主要化学成分的高效液相色谱定量分析方法，方法专属性强，定量精密度高，稳定性和重现性好，可为九节菖蒲质量标准的研究奠定基础。

对供试品溶液制备方法进行比较，结果表明，回流提取法所得总皂苷、齐墩果酸、腺苷含量最高，超声提取法最低，因此采用回流提取法处理样品。

[1]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京:人民卫生出版社，1978:13－14.

[2]江苏新医学院.中药大辞典[M].上海:上海科学技术出版社，2005:46－47.

[3]国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草(上册)[M].上海:上海科学技术出版社，1998:505－507.

[4]李婷婷，路 芳，杨秀东.九节营蒲研究进展[J].长春中医药大学学报，2006，22(3):68－69.

[5]邹忠杰，杨峻山.九节营蒲化学成分研究[J].中药材，2008，31(1):49－51.

[6]肖辉军.石营蒲与九节营蒲的鉴别使用[J].北京中医药，2011，30(1):56－57.

[7]鲁湘鄂.岗梅根中总皂苷的提取工艺研究[J].中国药业，2010，19(22):54－55.