凝胶色谱法测定头孢菌素中高分子杂质心得

孙凤岐 孙晓磊

摘要：本文叙述了凝胶色谱法测定头孢菌素中高分子杂质心得。

关键词：抗生素实验准备凝胶色谱柱操作方法

抗生素类药物中的高分子杂质是指药品中分子量大于药物本身的杂质，分子量一般在1000～5000，个别可至10000道尔顿左右。头孢菌素类药物中的高分子杂质主要成分为蛋白（多肽）类杂质和聚合物杂质两类，前者主要来自生产过程的残留或污染，后者主要是抗生素在生产、贮存和使用条件下发生的分子间的聚合反应产物。国内外大量的实验及临床研究证明，抗生素所致的速发型过敏反应和其中的高分子杂质有关，其含量对药品的质量有很大影响。

为提高药品纯度，减少不良反应的发生，头孢菌素类品种中高分子杂质的含量，获得很好效果。

(1)仪器与实验准备。仪器。采用液相色谱仪测定抗生素高分子杂质含量时，液相色谱仪部分应按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中 实验室液相色谱仪检定规程“（JJG705-90）”的规定作定期检定，应符合规定。仪器的具体使用应详细参阅各操作说明书。

采用自行配置的简易仪器或系统应包括输液单元、检测单元和记录及数据处理单元三部分。其中输液单元应能在实验过程中提供1m1/min左右稳定的流速，检测单元应具备满足标准规定波长在内的紫外检测能力，同时检测单元应能向记录单元（色谱工作站或积分记录仪）输出模拟信号，以进行数据的记录和处理。自行配置的仪器系统可以参照液相色谱仪的检测规定，拟定自检规程和能达到的技术指标，并定期检定，以保证实验的重现性。

(2)凝胶色谱柱准备。色谱柱体积规格的选择应根据仪器系统的最大进样能力、所分析样品的溶解能力和检测限度要求综合考虑。通常凝胶色谱柱的载样能力（体积）小于柱床体积的2%。一般头孢菌素抗生素高分子杂质测定的柱床体积应为60m1以上。

玻璃柱管的分端。开口的玻璃柱管可以采用玻璃棉加开口橡胶塞封端，或者在一端烧结石英过滤板，也可以直接购买带调节头的商品玻璃柱管。

凝胶介质。凝胶色谱法可选用的凝胶有多种，目前中国药典中抗生素高分子杂质测定时多采用葡聚糖凝胶SephadeXG10.Sephade XG10通常为干粉，用前需用水充分溶胀。每1g SephadeXG10干粉溶胀后的柱床体积约2-3m1,可以根据需要填制的凝胶柱柱床体积计算SephadeXG10干粉的用量。溶胀采用蒸馏水浸泡，可在4℃冰箱中放置48小时，也可在水浴中煮沸一小时，以保证溶胀充分。在两种溶胀方式中，均应随时搅拌出去气泡，如有必要还可进一步真空脱气。

装柱。将溶胀好的凝胶介质用蒸馏水悬浮，静置后，每次倾去上层液，以去除凝胶碎屑和杂质。如此洗涤次数，直至上层精置液澄清为止。

可将凝胶介质用水制成70%（V/V）DE 悬浆，一次倒入垂直放置的玻璃柱管，待凝胶颗粒沉降完毕后即完成装柱。也可在垂直放置的玻璃柱管和漏斗，放开柱管下口，保持液流顺畅，用滴灌逐管从漏斗中加入凝胶悬浆，让凝胶颗粒在蒸馏水中缓慢沉降，注意让漏斗中随时保持一定的凝胶悬浆。此法装柱时间较长，必要时可以在出柱口增加负压加快装柱时间。新填装的色谱柱要先用水连续冲洗4～6小时，促使凝胶更紧密均匀地填充在柱管中。

凝胶柱的维护。凝胶柱应保证柱床连续、均一、平整，如发现凝胶收缩、变干断层或出现气泡，应将凝胶从柱管中倒出，重新装柱。如果仅仅在柱头发现少许污染或破坏，可用小勺将该部分凝胶挖掉弃去，加入少量流动相或水，用玻棒轻轻扰动凝胶面，静置，待凝胶颗粒重新沉降后封闭柱头即可。

凝胶柱恢复。一般测量方法中均可采用高浓度、大体积进样提高检测能力。可能在色谱柱中发生严重非特异性吸附，一方面可能改变凝胶色谱柱的分离机制，另一方面有可能造成柱堵塞，柱压升高。此时应对凝胶进行恢复处理。

凝胶柱保存。溶胀的凝胶以及凝胶色谱柱可保存在0.02%的NaN3或20%的乙醇溶液中，以控制微生物的生长。

系统适用性实验。系统适用性试验包括下列内容：

考察对照品测定系统与高分子杂质测定系统中蓝色葡聚糖2000溶液峰的保留时间的比值、理论板数和拖尾因子，来控制对照品测定与高分子杂质测定时仪器状态的同一性；

以蓝色葡聚糖2000的保留时间来表示高分子杂质的保留特征，考察对照品色谱峰及高分子杂质色谱峰与蓝色葡聚糖2000溶液色谱峰保留时间的比值均应不超过某一限度，从而控制色谱柱状态是否正常；

考察对照品溶液重复进样后峰面积的相对标准偏差应符合规定。

(3)操作方法。样品溶液的制备。按标准规定配制样品溶液。由于某些高浓度抗生素溶液不稳定，通常要求样品溶液即溶即进。

对照溶液的制备。头孢菌高分子杂质含量测定，通常以样品自身在SDS水溶液或纯水中的缔合物作为对照进行定量。在制备缔合物时，应注意对浓度、水的纯度等条件的控制，以保证缔合完全。

进样。头孢菌素高分子杂质含量测定对照溶液分别在不同流动相状态下进样，更换流动相后凝胶色谱柱应充分平衡后才能进样。

进样方式可以采用色谱仪自动进样，也可以采用手动方式。两种进样方式均要求色谱柱端没有死体积，以避免样品扩散，造成峰展宽甚至影响分离。自动进样操作可以参照有关液相色谱操作规程进行，手动进样方式主要用于开口柱。

手动进样方式，应凝胶面表面平整。进样前用滴灌轻轻吸掉凝胶上的液体，保持色谱柱下端流畅，待柱内液体刚刚降至凝胶面之下时，用定量器具精密量取规定体积的样品溶液小心加入到色谱柱凝胶表面上，待样品溶液刚刚降至凝胶表面以下时，吸取少量流动相沿色谱柱管内壁缓缓加入，以洗下残留在色谱柱管壁的样品溶液，再从柱顶端加入一定量的流动相，并恢复流路，开始记录进样时间。

(4)分别记录样品和对照溶液的色谱图，积分对照溶液的峰面积和样品溶液中处于外水体积的高聚物杂质面积，按外标法以峰面积计算样品中高分子杂质的含量。

(5)结果与判断。按平行实验的平均值作为样品中高分子杂质含量的最终结果，并与标准规定限度比较，作出是否符合规定的判断。

(6)样量分析。如果在一般高效液相色谱仪上使用凝胶柱，应将泵压严格限制在1Mpa以内。并且，由于一般高压液相色谱管路和检测器通路狭窄，容易堵塞，应尽量减少将出柱液连接到检测器的时间，尤其新填充的色谱柱，应经水或流动相充分平衡后再连接到检测器。

通過实验论证根据系统的情况进行样量分析。