HPLC法测定灵芝孢子油中甘油三油酸酯含量

曾荣华 李菁

（1中药提取分离过程现代化国家工程研究中心，广东广州，510240；2广州汉方现代中药研究开发有限公司）

HPLC法测定灵芝孢子油中甘油三油酸酯含量

曾荣华1，2李菁1，2

（1中药提取分离过程现代化国家工程研究中心，广东广州，510240；2广州汉方现代中药研究开发有限公司）

目的：建立高效液相色谱法（HPLC）测定灵芝孢子油中甘油三油酸酯含量的方法。方法：色谱柱为Kromasil 100-5C18，流动相为乙腈-异丙醇（53∶47），流速为1.0m L/m in，蒸发光散射检测器检测。结果：甘油三油酸酯在2.290~13.740μg范围内线性关系良好，r=0.999 6，平均回收率为99.10%，RSD为1.65%。结论：该方法准确可行、重复性好，可作为灵芝孢子油及其制剂质量评价的方法之一。

灵芝孢子油；甘油三油酸酯；高效液相色谱法

灵芝孢子是灵芝生长成熟期从菌盖弹射出来极其细小的孢子，为灵芝的生殖细胞，具有灵芝的全部遗传活性物质，能够滋养强壮、扶正固本、补益精气、宁心安神、健脾和胃。灵芝孢子油是由灵芝孢子粉经CO2超临界萃取而得的脂溶性物质，主要以甘油三酯形式存在，还含有少量游离脂肪酸和类固醇酯[1]。功效研究表明具有抗肿瘤和调节免疫、护肝等功能[2-5]。本研究在前期对灵芝孢子油中甘油三酯类成分的分离与鉴定研究的基础上，建立了灵芝孢子油中甘油三油酸酯的含量测定方法，为灵芝孢子油及其制剂产品的质量控制提供有效方法和检验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters2695型液相色谱仪及工作站，配备Sedere Sedex 75型蒸发光散射检测器。

1.2 试药

甘油三油酸酯对照品（Sigma公司，批号：119K1373），供含量测定用；灵芝孢子油，广州汉方现代中药研究开发有限公司提供；乙腈、异丙醇为色谱纯，其他为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Kromasil 100-5C18色谱柱（250mm×4.6 mm，5μm）；柱温：30℃；流动相:乙腈 - 异丙醇（53∶47）；流速：1.0 m L/m in。蒸发光散射检测器检测：温度60℃，氮气压力 350 kPa。

2.2 供试品溶液的制备

取灵芝孢子油约100mg，精密称定，置25 m L量瓶中，加入流动相溶解并稀释至刻度，微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取甘油三油酸酯对照品 4.58 mg，置10 m L量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.4 系统适应性考察

分别取对照品溶液5μL，供试品溶液 10μL注入色谱仪，记录色谱图（见图1、2），结果甘油三油酸酯与样品中其他成分峰能较好分离。

图1 甘油三油酸酯对照品HPLC图

图2 灵芝孢子油HPLC图

2.5 线性关系考察

取2.3项下甘油三油酸酯对照品溶液，分别进样 5、10、15、20、30μL，记录峰面积，取峰面积的对数（Y）及进样量的对数（X）进行线性回归，得回归方程：Y=1.720 8 X+5.036 1，r＝ 0.999 6，结果显示，甘油三油酸酯在2.290~13.740μg范围内线性良好。

2.6 精密度试验

取对照品溶液10μL，按2.1项中的条件连续进样6次，记录峰面积。结果峰面积RSD=1.21%，表明进样精密度符合规定。

另取同批样品，按2.2项下操作，以2.1项中的条件连续进样6次，记录峰面积，结果峰面积RSD=1.32%，表明进样精密度符合规定。

2.7 稳定性试验

取同批样品，按2.2项下处理后，以2.1项中的条件每隔一定时间进样测定一次，进样时间分别为 0、5、10、17、24 h，每次进样 10μL，记录峰面积。结果峰面积 RSD=1.89%，表明供试溶液在24 h内稳定。

2.8 重复性试验

取同批样品6份，各约100mg，精密称定，按2.2项下操作，以2.1项中的条件测定，每份重复进样2次，进样量10μL，按标准曲线计算甘油三油酸酯含量，结果RSD=1.62%，表明方法重复性较好。

2.9 加样回收率试验

取同批样品6份，各约50mg，精密称定，置25m L量瓶中，加入甘油三油酸酯对照品溶液（7.950mg/m L）各1m L，用流动相稀释至刻度，以2.1项中的条件测定，每份重复进样2次，进样量10μL，记录峰面积，按标准曲线计算甘油三油酸酯的含量。结果见表1。

2.10 含量测定

取10批样品，按2.2项下制备供试品溶液，每批样品平行制备2份，每份重复进样2次，色谱条件如2.1项下所示。记录峰面积，按标准曲线方程计算甘油三油酸酯的含量。结果见表2。

表1 加样回收试验

3 讨论

3.1 目前控制灵芝孢子油的质量主要采用紫外光谱法测定灵芝孢子油中的总三萜含量，但大量的文献报道灵芝子实体中含有三萜类成分，而在灵芝孢子粉中较少报道三萜类成分，因此测定灵芝孢子粉或灵芝孢子油中三萜类成分的专属性不强，用来评价孢子粉及孢子油的质量有一定的局限性。鉴于前期研究及文献报道灵芝孢子油主要含有甘油三酯类组分，本研究采用HPLC测定灵芝孢子油中的甘油三油酸酯含量，作为控制灵芝孢子油质量的有效方法之一，该方法操作简便，重现性好，特有性强。

表2 10批灵芝孢子油测定结果

3.2 灵芝孢子油中主要含有甘油三酯类成分，而甘油三酯类成分无紫外吸收，且不易挥发，因此适宜采用蒸发光散射检测器进行检测。经研究，在漂移管温度为60℃，氮气压力为350 kPa时信号响应较佳。此外，对流动相的比例，流速，柱温等液相条件进行考察，发现柱温为30℃，流动相为乙腈：异丙醇（53∶47），流速为 1.0 m L/m in，其出峰时间、分离度等都较佳，达到了含量测定的要求。

[1]王杉，周科勤，范青生，等.超临界CO2萃取菌草灵芝孢子油中三萜类物质和脂肪酸的测定[J].食品安全与检测，2006，22（1）：74-76.

[2]梁坚，杨俊峰，何为涛，等.灵芝孢子油软胶囊对小鼠免疫功能调节的研究[J].中国热带医学，2005，5（6）： 1189-1191.

[3]李森柱，谢意珍，周静文，等.灵芝孢子油主要活性成分及降血脂功能的研究[J].中国食用菌，2006，25（5）：40-42.

[4]黄健康，王凤岩，黄琼，等.灵芝孢子油增强小鼠免疫功能及护肝作用的实验研究[J].现代预防医学，2007，34（7）：1272-1274.

[5]Xie Yi-Zhen，Li Sen-Zhu，Albert Yee，et al.Canoderma lucidum inhibits tumour cellproliferation and induces tumour celldeath[J].Enzyme and M icrobial Technology， 2006，40（1）：177-185.

Content Determination of Glycerol Trioleate in Ganoderma lucidum Spore Oilby HPLC

Zeng Ronghua1，2， Li Jing1，2（1 National Engineering Research Center for Modernization of Extraction and Separation Process of TCM，Guangdong Guangzhou 510240，China；2 Guangzhou Hanfang Natural Medicine R&D Co.，Ltd.）

Objective:To establish the method for determining the content of glycerol trioleate in Ganoderma lucidum spore oil（GLSO）by HPLC.M ethods:Kromasil C18analytical column was used with acetonitrile-isopropanol（53∶47） as the mobile phase.The flow rate was 1.0 m L/min and evaporative light-scattering detector was used.Results： A good linear was obtained in the range of 2.290~13.740μg for glycerol trioleate（r=0.999 6）.The average recovery was 99.10%（RSD=1.65%）.Conclusion： Themethod is simple and accurate with a good reproducibility and can be applied to the quality control of GLSO.

Ganoderma Lucidum Spore Oil；Glycerol Trioleate；HPLC

10.3969/j.issn.1672-5433.2012.08.005

广州市科技攻关重点项目——灵芝孢子油静脉注射乳剂的研究与开发（2006Z2-E5081）

曾荣华，女，研究员。研究方向：中药研发。E-mail:xiaohua305@163.com

2012-01-18）