肿瘤转移抑制基因TIP30／CC3在膀胱尿路上皮癌中的作用

陕 光 夏 樾

（武汉大学人民医院泌尿Ⅱ科 湖北430060）

TIP30／CC3（Tat interacting protein 30）基因是2007年由国外学者首先报道的一种与肿瘤转移抑制相关的基因［1］，其编码产物TIP30／CC3蛋白是一种丝氨酸、苏氨酸激酶，以细胞辅助因子为个体，具有活化并增高HIV-1转录功能，可特异性地提高HIV-1增殖调节蛋白Tat的转录［2］。TIP30基因具有抑制肿瘤转移、促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤血管形成等作用［3－5］。

我们通过免疫组织化学方法观察TIP30／CC3蛋白与膀胱尿路上皮癌中的表达，以期能进一步探讨其在膀胱尿路上皮癌发生发展中的作用，为肿瘤的靶向治疗提供新的依据。

材料和方法

1.材 料

收集武汉大学人民医院病理科2004-2006年膀胱尿路上皮癌存档蜡块50例（均经病理学证实为膀胱尿路上皮癌），其中男性38例，女性12例，平均年龄50.3岁，另5例癌旁组织距瘤缘3-5cm做对照。标本均经HE染色，光镜观察诊断，按 WHO尿路肿瘤组织学分类（2004），浸润性尿路上皮癌30例，非浸润性乳头状尿路上皮癌；高级别15例，低级别5例；按 UICC临床分期，T1 31例，T2 11例，T3-4 8例。其中未经化疗的初发肿瘤28例，化疗后复发肿瘤22例。

2.方 法

2.1 HE染色

常规取材、固定、脱水、透明、包埋、切片、HE染色及封片。

2.2 主要试剂

即用型兔抗人TIP30／CC3多克隆抗体（北京中杉生物技术有限公司）；超敏即用型SP通用型免疫组织化学试剂盒（北京中杉生物技术有限公司）；DAB显色试盒及多聚赖氨酸（北京中杉生物技术有限公司）。

2.3 免疫组织化学SP法检测TIP30／CC3相关抗原

具体步骤：5μm组织切片常规脱蜡至水后，0.01mol／L PBS（pH 7.4）漂洗3×3min；抗原修复，室温自然冷却后，0.01mol／L PBS（pH 7.4）漂洗5×3min；滴加3%过氧化氢，37℃湿盒孵育10min以抑制内源性过氧化物酶活性，0.01mol／L PBS（pH 7.4）漂洗3×3min；正常羊血清37℃湿盒孵育10min以减少非特异性背景；甩去多余血清，分别滴加一抗，4℃孵育过夜，0.01mol／L PBS（pH 7.4）漂洗3×5min；滴加生物素标记的二抗37℃湿盒孵育10min，0.01mol／L PBS（pH 7.4）漂洗3×3min；滴加链霉素抗生物素蛋白－过氧化物复合物37℃湿盒孵育10min，0.01mol／L PBS（pH 7.4）漂洗3×3 min；滴加新鲜配置的DAB显色液显色，光镜下控制反应时间（约3-5min），自来水冲洗终止反应；苏木素复染，流水冲洗，1%盐酸酒精分色数秒，流水冲洗，0.1%氨水返蓝；梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片并镜检；用PBS代替一抗作为阴性对照，购买的阳性片作为TIP30／CC3的阳性对照。

2.4 免疫组织化学结果判断

2.4.1 TIP30／CC3以胞膜或胞质出现棕黄色颗粒为阳性反应，阴性对照组除细胞核染成蓝色外，应无棕黄色反应物。

2.4.2 采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告管理系统（同济千屏影像公司）对TIP30／CC3的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400），测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。（阳性面积率＝单位面积中阳性反应的总面积／单位面积中细胞的总面积×100%）

3.统 计学处理

对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和q检验，检验水准α为0.05。

结 果

1.T IP30／CC3的表达

尿路上皮癌细胞中可见少量的棕黄色颗粒，TIP30／CC3呈低表达（图1）；癌旁正常膀胱组织上皮中可见密集分布的棕黄色颗粒，TIP30／CC3呈高表达（图2）。图像分析结果见表。经q检验，膀胱尿路上皮癌与癌旁膀胱组织之间，TIP30／CC3的平均光密度及阳性面积率有显著性差异（P＜0.05）（表1）。

表1 膀胱尿路上皮癌和癌旁正常膀胱组织TIP30／CC3表达的平均光密度和阳性面积率（¯x±s）Table 1 The average optical density and the rate of positive area of TIP30／CC3 in bladder urothelial cancer and cancer side tissue（¯x±s）

2.T IP30／CC3基因与膀胱尿路上皮癌临床和病理特征的关系

TIP30／CC3的表达与患者年龄、性别之间的差异均无显著性（P＞0.05）。但与肿瘤浸润深度、分化程度和临床UICC分期之间的差异均有显著性 （P＜0.05）（表2）。

表2 TIP30／CC3与膀胱尿路上皮癌病理分级临床分期的关系Table 2 TIP30／CC3with the correlation of Pathologic type and TNM stag of Bladder Urothelial Cancer

讨 论

膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤，其中90%以上为膀胱尿路上皮癌，其发生、发展是一个多基因、多步骤的过程，探讨膀胱尿路上皮癌的发生、发展及其转移机制，对膀胱尿路上皮癌的早期诊断、治疗方式的选择及预后判断等方面具有重要价值［6］。

人的TIP30蛋白是能特异性地提高HIV-1增殖调节蛋白Tat的转录辅助因子，其序列与CC3蛋白是相同的，而CC3蛋白是与肿瘤转移抑制有关的［7］。TIP30／CC3是短链脱氢酶／还原酶（SDR）家族的一个成员，也是一个丝氨酸／苏氨酸激酶［8－10］。它的抑癌功能不断得到发现和证实，作用机制也被不断深入研究，为肿瘤治疗带来了新的希望。一些新的促凋亡途径的提出，加深了人们对这一方面的了解。

研究发现，肿瘤转移表型和细胞凋亡之间存在着密切关系，诱导或促进细胞凋亡可以抑制肿瘤细胞发生转移［11］。分子生物学试验表明，TIP30促进细胞凋亡和抑制细胞转移的功能是通过该基因作为转录辅助因子，调节凋亡相关基因和血管新生相关基因的表达实现的［12－14］。

我们采用免疫组织化学的方法，对膀胱尿路上皮癌组织中TIP30／CC3的表达进行检测，旨在探讨其与膀胱尿路上皮癌发生发展的关系。结果发现：TIP30／CC3在膀胱尿路上皮癌中呈低表达，而在癌旁组织中呈高表达，差异有显著性。癌症的发生是一个复杂的过程，是多因素、多基因发生改变所造成的。通过我们实验的结果提示：抑癌基因TIP30在膀胱尿路上皮癌组织中的失表达可能促进了膀胱尿路上皮癌发生。抑癌作用是一个复杂的多因素共同作用的。TIP30／CC3基因具有促凋亡作用，它通过高表达可以上调一系列促凋亡基因的表达，以抑制肿瘤生长。而癌旁组织中TIP30的高表达可以抑制膀胱尿路上皮癌的发生和发展。对临床的早期诊断及治疗起到指导性作用。同时我们的实验结果也显示：TIP30／CC3基因与与膀胱尿路上皮癌病理分级、临床分期差异有显著性（P＜0.05）。提示：TIP30／CC3可能参与了膀胱尿路上皮癌发生、发展、转移、浸润的过程。因此，进一步研究TIP30基因与膀胱尿路上皮癌其它生物学指标的关系及其相互作用机制，将有助于了解膀胱尿路上皮癌发病的分子生物学机制，进而指导临床治疗。今后的实验中我们将进一步探索TIP30基因在多种肿瘤组织表达降低的机制，涉及到哪些分子调控通路，并希望通过基因或蛋白水平的干预来阻断其分子调控通路，为今后多种肿瘤的生物治疗提供实验依据。

［1］Zhao J，Ni H，Ma Y，et a1.TIP30／CC3expression in breast carcinoma：relation to metastasis，clinicopathologic parameters，and P53expression.Hum Pathol，2007，38（2）：293-298

［2］Zhang DH，Wong LL，Tai LK，et a1.Overexpression of CC3／TIP30is associated with HER-2／neu status in breast cancer.J Cancer Res Clin Oncol，2005，131（9）：603-608

［3］El Omari K，Bird LE，Nichols CE，et a1.Crystal structure of CC3 （TIP30）：implications for its role as a tumor suppressor.J Biol Chem.2005，280（18）：18229-18236

［4］Zhang X，Ouyang XN，Li XD，et al.Effects of tumor suppressing gene TIP30／CC3on the growth of tumor cells.Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi，2005，13（1）：38-41

［5］Lee LW，Zhang DH，Lee KT，et al.CC3／TIP30expression was strongly associated with HER-2／NEU status in breast cancer.Ann Acad Med Singapore，2004，33（5 Suppl）：S30-32

［6］Black PC.Molecular signaling and the role of targeted therapies in bladder cancer.Minerva Urol Nefrol，2012，64（1）：7-17

［7］Sonveaux P.Loss of CC3／TIP30allows tumor cells to cope with low glucose.Cell Cycle，2011，10（3）：376-381［8］Zhang C，Li A，Zhang X，et a1.A novel TIP30protein complex regulates EGF receptor signaling and endocytic degradation.J Biol Chem，2011，286（11）：9373-9381

［9］Chen V，Shtivelman E.CC3／TIP30regulates metabolic adaptation of tumor cells to glucose limitation.Cell Cycle，2010，9（24）：4941-4953

［10］Fong S，King F，Shtivelman E.CC3／TIP30affects DNA damage repair.BMC Cell Biol，2010，7（11）：23-32

［11］Chen X，Cao X，Dong W，et al.Jin Y.Expression of TIP30tumor suppressor gene is down-regulated in hu-man colorectal carcinoma.Dig Dis Sci，2010，55（8）：2219-2226

［12］Tong X，Li K，Luo Z，et al.Decreased TIP30expression promotes tumor metastasis in lung cancer.Am J Pathol，2009，174（5）：1931-1939

［13］Zhang H，Zhang Y，Duan HO，et al.TIP30is associated with progression and metastasis of prostate cancer.Int J Cancer，2008，123（4）：810-816

［14］Zhao J，Chen J，Lu B，et al.TIP30induces apoptosis under oxidative stress through stabilization of p53 messenger RNA in human hepatocellular carcinoma Cancer Res，2008，68（11）：4133-4141

图 版 说 明EXPLANATION OF FIGURES

图1 TIP30／CC3的表达：膀胱尿路上皮癌 细胞膜和胞浆内可见少量的棕黄色颗粒，TIP30／CC3呈阴性表达（→）。SP×200

图2 TIP30／CC3的表达：癌旁正常膀胱组织 细胞核和胞浆内可见较多棕黄色颗粒，TIP30／CC3呈阳性表达（→）。SP×200

Fig.1The expression of TIP30／CC3：bladder urothelial cancer group：There were few brown particles in the nucleus or cytoplasm，which showed TIP30／CC3expressed negative.SP×200

Fig.2The expression of TIP30／CC3：cancer side tissue：There were plenty of brown particles in the nucleus or cytoplasm，which showed TIP30／CC3expressed positive.SP×200