糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链蛋白(GILZ)在人气道上皮细胞中的表达及对MAPK信号通路的影响①

刘静月 符 州 张明香 刘恩梅 罗征秀 王莉佳

(重庆医科大学附属儿童医院呼吸中心，重庆400014)

糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链蛋白(GILZ)在人气道上皮细胞中的表达及对MAPK信号通路的影响①

刘静月②符 州 张明香 刘恩梅 罗征秀 王莉佳②

(重庆医科大学附属儿童医院呼吸中心，重庆400014)

目的:探讨糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链蛋白(GILZ)在人气道上皮细胞9HTE0中的表达以及对MAPK信号通路因子Raf-1、Mek1/2、Erk1/2的影响。方法:采用RT-PCR及Western blot法检测地塞米松(Dex)作用后GILZ mRNA及蛋白的表达，同时细胞免疫荧光法检测GILZ蛋白的定位;合成三条GILZ-SiRNA分别转染人气道上皮细胞9HTE0，用Q-PCR及Western blot法筛选出沉默效果最佳的一条;Western blot法检测MAPK信号通路因子Raf-1、Mek1/2、Erk1/2磷酸化蛋白及其总蛋白的表达。结果:Dex能够明显刺激人气道上皮细胞9HTE0GILZ mRNA及蛋白的表达，GILZ蛋白主要定位在细胞浆中，Dex抑制了Raf-1、Mek1/2、Erk1/2磷酸化蛋白的表达，而GILZ-SiRNA转染后，Raf-1.Mek1/2、Erk1/2磷酸化水平有所回升。结论:糖皮质激素作为支气管哮喘一线用药，虽然能够诱导GILZ表达并发挥一定的抗炎作用，但同时GILZ却抑制了在气道上皮修复中起重要作用的MAPK信号通路的激活，这为临床上研究哮喘防治新措施提供了理论依据。

糖皮质激素;GILZ;气道上皮细胞;MAPK;支气管哮喘

糖皮质激素(Glucocorticoid，GC)是一类由肾上腺皮质分泌的甾体激素，它调节着糖、脂肪以及蛋白质的生物合成和代谢，同时还有抗过敏、抗炎以及免疫抑制的作用。在哮喘治疗中GC作为一线药物在临床上被广泛应用，其中糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链蛋白(Glucocorticoid-induced leucine zipper，GILZ)是GC重要的抗炎介导者[1]，但同时它还能与促分裂原活化的蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族成员相互作用，抑制信号通路的磷酸化，从而抑制气道上皮损伤后修复的过程[2，3]。在支气管哮喘的发生发展中，气道变化贯穿着整个病理过程，气道上皮是外部环境与机体内环境相互作用的屏障，本研究通过地塞米松(Dexamethasone，Dex)处理人气道上皮细胞9HTE0，观察GILZ的表达情况及其对MAPK信号通路的影响，为临床上进一步研究哮喘防治新措施提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂 人气道上皮细胞9HTE0(美国模式培养物保藏所，ATCC)，由重庆医科大学附属儿童医院研究所呼吸研究室保存，胎牛血清、OPTI-MEM购自Gibco公司，Dex购自Sigma公司，总RNA快速提取试剂盒、BCA法蛋白定量试剂盒购自 Bioteke公司，PrimeScript RT reagent Kit购自TaKaRa公司，RealMasterMix(SYBR Green)购自天根公司，Lipofectamine 2000购自 Invitrogen公司，GILZ、β-actin、GAPDH 引物、GILZ-SiRNA 等合成自Invitrogen公司，小鼠抗人GILZ单克隆抗体购自Santa Cruz公司，兔抗人 p-Raf-1、Raf-1、p-Mek1/2、Mek1/2、p-Erk1/2、Erk1/2单克隆及多克隆抗体购自Cell Signaling Technology公司，抗β-actin鼠单克隆抗体、山羊抗小鼠DyLight488荧光二抗购自康为世纪公司，辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠/兔二抗购自联科生物公司，全蛋白提取试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、ECL检测试剂盒购自凯基公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 9HTE0细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养液中37℃、5%CO2孵箱常规培养，倒置显微镜下定时观察细胞生长状态。每2～3天待细胞长满培养瓶的80%～90%左右消化传代。

1.2.2 RT-PCR 法检测 GILZ mRNA 在9HTE0细胞中表达情况 将9HTE0细胞以每孔5×105个细胞铺于6孔板中，贴壁后加入终浓度10 μmol/L Dex培养6、12、24小时，按说明书提取细胞总 RNA，逆转录合成 cDNA。引物为:GILZ(F:5′-TGGTGGTTCTGCGGTGTAAGTG-3′，R:5′-CTCCTCGTGAGATGATGCTTGG-3′，扩增长度为 115 bp)，β-actin(F:5′-GTGGACATCCGCAAAGAC-3′，R:5′-GAAAGGGTGTAACGCAACT-3′，扩增长度为303 bp)。反应条件: 94℃预变性 4分钟，94℃变性 30秒，64℃ 复性(GILZ)/60℃复性(β-actin)30秒，72℃延伸45秒，35次(GILZ)/30次(β-actin)循环，72℃再延伸5分钟。将扩增产物110 V下行1.5%琼脂糖凝胶电泳。

1.2.3 细胞免疫荧光法(ICC)检测GILZ蛋白在9HTE0细胞中的表达定位 将9HTE0细胞悬液以5×104个/孔的细胞数铺于有小玻片的24孔板中，贴壁后加入终浓度10 μmol/L Dex培养6小时，4%多聚甲醛室温固定30分钟，0.1%TritonX-100室温透膜10分钟，5%BSA室温封闭30分钟，滴加一抗4℃过夜后，滴加二抗37℃孵育45分钟，DAPI染核，漂洗，抗淬灭剂封片，荧光观察。

1.2.4 Lipofectamine 2000转染9HTE0细胞 用无抗无血清DMEM培养9HTE0细胞，根据转染试剂说明书按比例加入OPTI-MEM和SiRNA(GILZ-SiRNA1:5′-GGAUCUGGUGAAGAAUCAUTT-3′，GILZ-SiRNA2:5′-GAACUCCCAGCUAGAGCGUTT-3′，GILZ-SiRNA3:5′-GUUCCAGUCCUGUCUGAGCTT-3′)的混合液于培养基中轻轻混匀，6小时后更换新鲜培养基，24小时时加入终浓度10 μmol/L Dex刺激，48小时时提取细胞RNA并逆转成cDNA，-20℃保存及提取蛋白BCA测蛋白浓度后，-80℃保存备用。

1.2.5 Q-PCR检测 3条 GILZ-SiRNAs沉默后的GILZ mRNA水平 将保存的cDNA取出，用SYBR Green 检测各组(GILZ-SiRNA1、GILZ-SiRNA2、GILZSiRNA3、阴性对照、GAPDH阳性对照)GILZ mRNA水平。GAPDH 引物:F:5′-AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC-3′，R:5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′，扩增长度为203 bp。反应条件:95℃预变性3分钟，40次循环[95℃变性30秒，64℃退火(GILZ)/60℃退火(GAPDH)30秒]两步法。

1.2.6 蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测GILZ蛋白的表达情况及其对Raf-1、Mek1/2、Erk1/2磷酸化蛋白及总蛋白的影响 按蛋白分子量配制相应浓度的SDS-PAGE凝胶，蛋白于100℃沸煮5分钟后，取总蛋白100μg在浓缩胶60 V、分离胶120 V下电泳，电泳结束后将蛋白半干转到PVDF膜上，5%的BSA室温下封闭1小时，TBST洗膜10分钟×3次，用封闭液稀释的 GILZ(1∶100)/β-actin(1∶2 000)/ p-Raf-1、Raf-1、p-Mek1/2、Mek1/2、p-Erk1/2、Erk1/2 (1∶1 000)4℃孵育过夜，TBST洗膜10分钟×3次，再用封闭液稀释的辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠/兔二抗(1∶5 000)室温下孵育1～2小时，TBST洗膜10分钟×3次，按ECL显色试剂盒说明书操作曝光显影。

1.3 统计学分析 采用SPSS16.0统计软件行组间方差分析，数据以±s表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Dex诱导人气道上皮细胞9HTE0GILZ mRNA的表达 RT-PCR检测人气道上皮细胞9HTE0在10 μmol/L Dex作用6、12及24小时后，6小时 GILZ mRNA即出现显著增高，12、24小时仍明显高于正常组，如图1所示。

2.2 Dex诱导人气道上皮细胞9HTE0GILZ蛋白的定位 细胞免疫荧光发现GILZ蛋白主要定位于细胞浆中，10 μmol/L Dex作用6小时后可见GILZ蛋白表达明显高于正常组，如图2所示。

2.3 Dex诱导人气道上皮细胞9HTE0GILZ蛋白的表达 人气道上皮细胞9HTE0在10 μmol/L Dex作用6、12、24小时后，可见正常组GILZ蛋白无明显表达，6小时时表达即出现明显增高，12小时达到高峰，如图3所示。

2.4 GILZ-SiRNAs转染人气道上皮细胞9HTE0后GILZ mRNA的沉默效果鉴定 Q-PCR检测三条GILZ-SiRNAs的沉默效果，control组(0.61 ±0.24)与 Si-negative组(0.51 ±0.20)比较，差异无统计学意义(P ＞0.05);GILZ-SiRNA1、GILZ-SiRNA3 分别为(0.27 ±0.06)、(0.22 ±0.04)，与 Si-negative 组比较差异具有统计学意义(P＜0.05);GILZ-SiRNA2为(0.36±0.12)，与 Si-negative组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。由此可以看出GILZ-SiRNA3的沉默效果最佳，相对Si-negative组的沉默效率可达到55.8%，故选用GILZ-SiRNA3进行后续实验，如图4所示。

图1 不同时间点GILZ mRNA RT-PCR图Fig.1 RT-PCR of GILZ mRNA in different times

图2 GILZ蛋白免疫荧光的观察(×400)Fig.2 The fluorescence expression of GILZ protein(×400)

图3 不同时间点GILZ蛋白在9HTE0中表达Fig.3 The expression of GILZ protein in different times in 9HTE0

2.5 GILZ-SiRNA3转染人气道上皮细胞9HTE0后GILZ蛋白的表达 将GILZ-SiRNA3转染9HTE0后，WB检测其蛋白沉默情况，可见GILZ-SiRNA3蛋白表达量较对照组明显减少，蛋白沉默效果佳，如图5所示。

2.6 GILZ对MAPK信号通路因子 Raf-1、Mek1/2、Erk1/2磷酸化及总蛋白的表达影响 GILZ-SiRNA3转染9HTE0后WB检测MAPK信号通路相关因子，可见在磷酸化水平上，Dex刺激组均抑制了MAPK信号通路相关因子Raf-1、Mek1/2、Erk1/2磷酸化蛋白的表达，而GILZ-SiRNA沉默组则减轻了Dex的抑制作用，提示 GILZ具有抑制 Raf-1、Mek1/2、Erk1/2磷酸化的作用;而在 Raf-1、Mek1/2、Erk1/2总蛋白水平上，各组无明显差异，提示GILZ不影响总蛋白表达，如图6所示。

图4 GILZ-SiRNAs转染9HTE0后GILZ mRNA的表达Fig.4 The expression of GILZ mRNA after GILZ-siRNAs transfected 9HTE0

图5 GILZ-SiRNA3转染9HTE0后GILZ蛋白的表达Fig.5 The expression of GILZ protein after GILZ-SiRNA3 transfected 9HTE0

图6 MAPK信号通路因子Raf-1、Mek1/2、Erk1/2磷酸化及总蛋白的表达Fig.6 The expression of phosphorylated and total proteins of Raf-1，Mek1/2，Erk1/2

3 讨论

支气管哮喘是严重威胁人类健康的常见病，其发病率和死亡率仍呈逐年上升的趋势，GC作为治疗支气管哮喘的常用药物，虽然能有效控制气道炎症，但研究显示其对气道损伤后的修复有抑制作用。1997年意大利科学家D′Adamio等[4]在用Dex处理小鼠胸腺淋巴细胞时发现GILZ的表达后，对GILZ的研究随之展开。GILZ属于转录因子TSC-22家族，含有N末端结构域、中间的亮氨酸拉链结构和C末端的多聚脯氨酸富集结构域，可被临床上广泛使用的GC所诱导产生，并能在许多组织及细胞中被快速诱导，调节着增殖、分化以及凋亡等功能[5]，同时GILZ还抑制炎症分子NF-κB和AP-1的转录，调节T细胞的活化、IL-2的产生、抑制Raf-1信号通路以及增加上皮钠通道的数量等[2，6-8]。国外有研究显示Dex能够快速诱导多发性骨髓瘤细胞中GILZ的产生，同时在4小时内能诱导气道上皮细胞GILZ的表达并具有时间依赖性[9，10]。本文通过Dex作用于人气道上皮细胞9HTE0，发现正常组中GILZ的 mRNA表达含量较低，而几乎检测不到蛋白的表达，但在Dex刺激6小时时即可见明显的GILZ mRNA及蛋白的升高，提示 GC能够快速诱导 GILZ的表达。

气道上皮作为机体内外环境相互作用的屏障，其结构和功能的完整性是维持气道局部微环境的重要条件。气道上皮的损伤是哮喘的重要病理基础，长期使用GC可能是导致气道上皮损伤的重要危险因素，GILZ虽然在哮喘抗炎中发挥一定的作用，但同时GILZ也通过抑制Raf-1磷酸化阻断了MAPK信号通路的激活[2，11]。本实验证实 GILZ 抑制了MAPK信号通路因子Raf-1、Mek1/2、Erk1/2蛋白磷酸化水平，从而影响了MAPK信号通路的传导，而气道上皮损伤后修复又主要是通过表皮生长因子与其受体相互作用，通过激活MAPK信号通路来实现的[12]，故GILZ在抗炎的同时也抑制了气道上皮的损伤后修复，为哮喘的治疗增加了难度。因此，如何发挥GILZ抗炎作用的同时，寻找到干预GILZ抑制气道上皮损伤后修复的药物，达到既控制哮喘气道炎症又促进气道上皮损伤后修复的目的，是我们下一步亟待研究的主要方向。

1 Riccardi C.GILZ(glucocorticoid-induced leucine zipper)，a mediator of the anti-inflammatory and immunosuppressive activity of glucocorticoids[J].Ann Ig，2010;22(1):53-59.

2 Ayroldi E，Zollo O，Macchiarulo A et al.Glucocorticoid-induced leucine zipper inhibits the Raf-extracellular signal-regulated kinase pathway by binding to Raf-1[J].Mol Cell Biol，2002;22(22):7929-7941.

3 Wadsworth S J，Nijmeh H S，Hall I P.Glucocorticoids increase repair potential in a novel in vitro human airway epithelial wounding model[J].J Clin Immunol，2006;26(4):376-387.

4 D’Adamio F，Zollo O，Moraca R et al.A new dexamethasone-induced gene of the leucine zipper family protects T lymphocytes from TCR/ CD3-activated cell death[J].Immunity，1997;7(6):803-812.

5 Ayroldi E，Riccardi C.Glucocorticoid-induced leucine zipper(GILZ): a new important mediator of glucocorticoid action [J].FASEB J，2009;23(11):3649-3658.

6 Ayroldi E，Migliorati G，Bruscoli S et al.Modulation of T-cell activation by the glucocorticoid-induced leucine zipper factor via inhibition of nuclear factor kappaB[J].Blood，2001;98(3):743-753.

7 Cannarile L，Fallarino F，Agostini M et al.Increased GILZ expression in transgenic mice up-regulates Th-2 lymphokines[J].Blood，2006;107(3):1039-1047.

8 Soundararajan R，Melters D，Shih I C et al.Epithelial sodium channel regulated by differential composition of a signaling complex[J].Proc Natl Acad Sci USA，2009;106(19):7804-7809.

9 Grugan K D，Ma C，Singhal S et al.Dual regulation of glucocorticoid-induced leucine zipper(GILZ)by the glucocorticoid receptor and the PI3-kinase/AKT pathways in multiple myeloma[J].J Steroid Biochem Mol Biol，2008;110(3-5):244-254.

10 Eddleston J，Herschbach J，Wagelie-Steffen A L et al.The anti-inflammatory effect of glucocorticoids is mediated by glucocorticoid-induced leucine zipper in epithelial cells[J].J Allergy Clin Immunol，2007;119(1):115-122.

11 Stellato C.Glucocorticoid actions on airway epithelial responses in immunity functional outcomes and molecular targets[J].J Allergy Clin Immunol，2007;120(6):1247-1263.

12 Wadsworth S J，Nijmeh H S，Hall I P.Glucocorticoids increase eepair potential in a novel in vitro human airway epithelial wounding model[J].J Clin Immunol，2006;26(4):376-387.

[收稿2012-03-29]

(编辑 许四平)

The expression of glucocorticoid-induced leucine zipper(GILZ)and its effect to MAPK signaling pathway in human airway epithelial cells

LIU Jing-Yue，FU Zhou，ZHANG Ming-Xiang，LIU En-Mei，LUO Zheng-Xiu，WANG Li-Jia.Respiratory Center，Children’s Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing 400014，China

Objective:To explore the expression of glucocorticoid-induced leucine zipper and the effect of GILZ to Raf-1，Mek1/2，Erk1/2 of MAPK signaling pathway in human airway epithelial 9HTE0cells.MethodsRT-PCR was used to detect GILZ mRNA.GILZ protein was tested by Western blot and located by immunofluorescence.Three synthetic GILZ-SiRNAs were respectively transfected into 9HTE0cells to screen out the best GILZ-SiRNA.Western blot assayed the phosphorylated and total proteins of Raf-1，Mek1/2，Erk1/2.ResultsGILZ mRNA and protein increased obviously with Dexamethasone stimulation and GILZ protein mainly expressed in cell cytoplasm of 9HTE0cells.The phosphorylation of Raf-1，Mek1/2，Erk1/2 protein of which Dexamethasone inhibited the expression rebounded after GILZ-SiRNA was transfected.ConclusionGlucocorticoid as the fist line treatment of asthma induced the expression of GILZ that played a certain anti-inflammatory effect，but GILZ inhibited the activation of MAPK signaling pathway which promoted the repair process of airway epithelial cells.This provided a theoretical basis for new therapeuticmeasures of clinical research in asthma.

Glucocorticoid;GILZ;Airway epithelial cell;MAPK;Asthma

R725.6

A

1000-484X(2012)08-0737-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2012.08.014①本文受国家自然科学基金项目(81070014)和重庆市卫生局重点项目(2010-01-46)资助

②重庆医科大学附属儿童医院发育疾病研究教育部重点实验室，重庆400014

刘静月(1985年-)，女，在读博士，主要从事哮喘发病机

理及防治的研究，E-mail:liujingyue219@yahoo.com.cn;通讯作者及指导教师:符 州(1963年-)，男，教授，博士生导师，主要从事小儿呼吸疾病的研究，E-mail:fu_ zhou79@yahoo.com.cn。