检测副溶血弧菌TDH斑点免疫胶体金渗滤法的研究①

杨靖亚 陆晓帆 王 珍

(上海海洋大学海洋科学研究院，上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海201306)

检测副溶血弧菌TDH斑点免疫胶体金渗滤法的研究①

杨靖亚 陆晓帆 王 珍

(上海海洋大学海洋科学研究院，上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海201306)

目的:制备特异性检测副溶血弧菌TDH的斑点免疫胶体金渗滤测试盒(Dot immunogold filtration assay，DIGFA)。方法:T6D4和T9H4两株抗体分别标记于金颗粒和点样于硝酸纤维素膜，通过双抗体夹心法来开发斑点免疫胶体金渗滤测试盒，并对测试盒的特异性、重复性、稳定性做了分析。结果:研制的斑点免疫胶体金渗滤测试盒能够特异性检测副溶血弧菌TDH，其最低检测限达到250 ng/ml TDH，该测试盒在4℃恒温条件下保存12周后仍表现出准确和稳定的检测结果。结论:成功制备了检测副溶血弧菌TDH的斑点免疫胶体金渗滤测试盒，对现场快速检测TDH提供了可靠的测试工具。

副溶血弧菌;耐热直接溶血毒素;斑点免疫胶体金渗滤法;快速检测

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus，Vp)是一种能引起食物中毒和旅游者腹泻的嗜盐性细菌，目前已知的副溶血弧菌有12种O抗原及59种K抗原，据其发酵糖类的情况可分为5个类型。各种弧菌对人和动物均有较强的毒力。食用虾、蟹、贝类等水产品所致副溶血弧菌食物中毒，起病急骤，常有腹痛、腹泻、呕吐、失水、畏寒及发热。腹痛多呈陈发性绞痛，常位于上腹部、脐周或回盲部。腹泻每日3～20余次不等，大便性状多样，多数为黄水样或黄糊便。约2%～16%呈典型的血水或洗肉水样便，部分病人的粪便可为脓血样或粘液血样。由于吐泻，患者常有失水现象，重度失水者可伴声哑和肌痉挛，个别病人血压下降、面色苍白或发绀以至意识不清。近年来副溶血弧菌引起食物中毒的发生规模以及人群暴露规模呈明显上升趋势，已成为我国首要的食源性致病菌[1]。目前研究显示，副溶血弧菌的主要致病因子是其产生的多种溶血毒素和尿素酶，分别有不耐热溶血毒素(Thermolabile hemolysin，TLH)、耐热直接溶血毒素(Thermostable direct hemolysin，TDH)、直接溶血相关毒素(TDH-related hemolysin，TRH)，其中耐热直接溶血毒素TDH是主要的致病因子[2]。TDH是一种细胞毒素，该毒素是不含糖或脂质的蛋白质，由165个氨基酸残基组成，富含天门冬酸和缬氨酸。其等电点约为4～5之间，最小和最大吸收光谱分别为250 nm和277 nm，分子量约46 kD，由两个相同的亚基组成[3]。

目前，国内外对于已报道的副溶血弧菌TDH的检测方法以多重PCR技术，荧光实时PCR技术，ELISA检测技术为主[4-6]。然而，这些方法始终摆脱不了耗时、费力、经济成本等不可避免的不足之处，在很大程度上限制了对于致病性副溶血弧菌在环境现场以及临床快速预防检测的实行，同时还考虑到这些方法对实验员的操作上要求较高和繁琐的仪器使用，根本不能够被广泛地运用于基层单位的检测应用、不能够达到真正意义的“快速”检测效果。

免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体检测的一种新型免疫标记技术。用胶体金颗粒标记抗体或抗原，以检测未知抗原或抗体的方法称免疫胶体金技术。她不仅具备了免疫学中抗原与抗体特异性结合的特点，同时还可以通过金颗粒聚集后的显色反应，最终能够快速、准确地检测出目的物，从采样到获得结果大约只需要10～15分钟左右[7，8]，从而完全满足副溶血弧菌TDH快速和操作简单的检测要求。

然而，国内外对于斑点免疫胶体金渗滤检测法用于TDH的检测未曾报道。因此，本文以期通过双抗体夹心检测原理结合于斑点免疫胶体金渗滤法，首次制备特异性针对副溶血弧菌TDH的快速检测试剂盒，实现能够满足于现场快速检测的要求。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 硝化纤维膜NC购于Whatman公司;TDH由本实验室制备所得;TDH单克隆抗体均由本实验室制备所得;牛血清白蛋白BSA、四氯金酸HAuCl4、柠檬酸三钠购置于Sigma公司;致病性副溶血弧菌ATCC33846(标准菌株)购于北京中原公司;沙门氏菌、大肠杆菌、单核细胞增多性李斯特菌、金黄色葡萄球菌、非致病性副溶血弧菌F188(从南美白对虾分离出，只含TLH不含TDH，通过生理生化试验和PCR分析，确定为非致病性副溶血弧菌)菌株均由上海海洋大学食品安全实验室惠赠;所有的化学试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 TDH的制备 37℃条件下对致病性副溶血弧菌ATCC 33846进行摇床扩大培养16小时，8 000 r/min离心取上清去掉菌体，硫酸铵盐析提取粗蛋白，然后依次经过 DEAE-纤维素、DEAE-Sephadex A-50、葡聚糖G-75层析纯化TDH，冷冻干燥纯化后的 TDH[9]，准确称量，溶解于少量 pH7.4，0.01 mol/L的PBS中。

1.2.2 胶体金颗粒的制备 一株抗TDH单克隆抗体T6D4由实验室制备所得，胶体金颗粒的制备过程根据文献[10]所报道。首先，将盛有 100 ml 0.01%HAuCl4的烧杯置于恒温磁力搅拌器彻底煮沸;随之迅速加入1.7 ml新鲜配制的1% 柠檬酸三钠;在不断的搅拌中继续加热煮沸;待液体颜色转变为酒红色后，追加煮沸5分钟即可。最后制备所得胶体金溶液收集与棕色玻璃瓶，并保存在4℃冰箱中。胶体金颗粒大小通过紫外分光光度计进行检测。

1.2.3 胶体金颗粒与待标记抗体的标记 对于胶体金颗粒与单克隆抗体的结合，单克隆抗体主要通过范德华力和疏水作用吸附于金颗粒表面[11]。在胶体金溶液中，金颗粒之间保持着静电排斥与范德华引力的平衡状态，然而一旦受到外界离子物质的干扰后，其平稳体系将随之破坏，范德华引力便会大大强于静电排斥力，因此颗粒间将会发生聚集反应，溶液也会有红色转变为蓝色以至灰色。若当胶体金溶液中金颗粒伴随着一定含量蛋白分子的吸附，此平衡不会被破坏，换言之，单克隆抗体将阻止该不稳定状态[12]，所以为了寻找最强的金颗粒与单克隆抗体的结合力，我们必须挑选出最佳的pH与抗体标记量。

最佳标记pH选择:通过0.1 mol/L K2CO3对胶体金溶液进行 pH 调整，设置了 pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0 的不同梯度;分别取不同的 pH 胶体金溶液各1 ml于试管中，每管中均加入10 μl 1 mg/ml的TDH单克隆抗体T6D4，充分混匀后室温静置30分钟;最后通过每管添加100 μl 10%NaCl (w/v)，根据溶液颜色的变化程度选出最佳标记pH，即胶体金溶液仍将保持为酒红色。

最佳标记单克隆抗体量的选择:通过0.1 mol/ L K2CO3对胶体金溶液进行最佳标记pH调整，取出1 ml胶体金溶液于各个玻璃试管中;每试管胶体金溶液中分别加入 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 μl 1 mg/ml的待标记TDH单克隆抗体T6D4;充分混匀后室温静置30分钟;最后通过每管添加100 μl 10%NaCl(w/v)，根据溶液颜色的变化程度选出最佳抗体标记量，即胶体金溶液仍将保持为酒红色。

胶体金-抗体复合溶液的制备:本文对10 ml制备的胶体金溶液(0.1 mol/L K2CO3调整到 pH7.4)中加入120%最佳标记量的TDH单克隆抗体T6D4进行标记;在磁力搅拌器的作用下，室温匀速搅拌60分钟，使胶体金溶液中的金颗粒与待标记TDH单克隆抗体T6D4充分吸附平衡;随后向胶体金复合物溶液中加入10%BSA(w/v)使复合物溶液中BSA的终浓度为1%，并在室温匀速条件下继续搅拌60分钟;然后将胶体金复合物液体13 000 r/min离心60分钟，仔细吸去上清液，最后用1 ml 0.01 mol/L PBS(含1%BSA)保存液重悬沉淀，并于4℃条件下保存。

1.2.4 斑点免疫胶体金渗滤检测盒的组装及使用1 μl 2 mg/ml单克隆抗体T9H4点样于15 mm× 15 mm面积大小的NC膜中点处，作为检测TDH的检测点，随后放置于37℃恒温条件下干燥30分钟;之后取出NC膜浸没在2%BSA的PBS封闭液中，在4℃条件下过夜封闭处理;然后取出用超纯水漂洗3次(30秒/次);最后在室温条件下自然晾干即可，待测试盒组装用。整个组装我们只需在NC膜下垫放64层抽取式面纸，用一次性塑料测试卡上下包裹即可。

对于整个检测过程包括以下步骤:滴加20 μl pH7.4 0.01 mol/L PBS(含 1%BSA)润湿 NC 膜;滴加60 μl检测样本溶液，待渗透NC膜;滴加40 μl pH7.4 0.01 mol/L PBS(含 1%Tween-20、1% BSA)洗涤NC膜;待溶液完全渗入NC膜后，滴加60 μl胶体金-抗体复合溶液，待完全渗入;最后滴加60 μl PBS洗涤液洗涤NC膜，即完成整个检测，耗时约为3分钟。若最终NC膜上出现红色斑点，说明检测样本中含有TDH，若无红色斑点说明样本为阴性。

1.2.5 斑点免疫胶体金渗滤测试盒的特异性试验在37℃ 180 r/min恒定条件下，对副溶血弧菌(含TDH)、沙门氏菌、大肠杆菌、单核细胞增多性李斯特菌、金黄色葡萄球菌和非致病性副溶血弧菌F188菌株进行液体增菌摇床培养24小时后，对所有菌液进行8 000 r/min离心10分钟，取上清液作为检测样本。

1.2.6 斑点免疫胶体金渗滤测试盒的灵敏度试验

用PBS将纯化的TDH毒素蛋白配置成不同的浓度，用测试盒进行检测。

1.2.7 斑点免疫胶体金渗滤测试盒的重复性试验对不同的样本多次进行测试，用来检验渗滤检测盒的结果重复性是否专一。

1.2.8 斑点免疫胶体金渗滤测试盒的稳定性试验将组装好的渗滤检测盒放在37℃、4℃恒温条件下保藏1、4、8、12和16周之后再用于检测样本，以期检验其稳定性。

2 结果

2.1 胶体金溶液的制备与金颗粒标记 通过柠檬酸三钠还原法制备了胶体金溶液，通过紫外可见分光光度计在700～400 nm对胶体金溶液的全波长扫描，制备出了在520 nm处有最大吸收峰的金颗粒(图1)。

通过最佳pH、标记量的摸索，确定了最佳标记条件为:pH7.4和4 μg TDH单克隆抗体T6D4/1ml胶体金溶液(图2)。运用紫外可见光光度计进行了扫描验证，溶液在535处有最大吸收峰(图1)。

2.2 斑点免疫胶体金渗滤测试盒的特异性试验按照制备的测试盒的操作步骤分别对ATCC33846 (含TDH)、沙门氏菌、大肠杆菌、单核细胞增多性李斯特菌、金黄色葡萄球菌和非致病性副溶血弧菌F188(含TLH、不含TDH)的上清液进行检测，以确定所制备的DIGFA对TDH检测的特异性。如图3所示，该检测盒呈现出了良好的特异性检测结果。

图1 胶体金溶液标记前后的紫外分光光度计波长扫描Fig.1 UV-visible spectra of colloidal gold and antibodygold conjugates

图2 最佳抗体标记量的分析Fig.2 Optimal condition of antibody concentration for coating

图3 斑点免疫胶体金渗滤测试盒的特异性分析Fig.3 The analysis of DIGFA specificity

图4 斑点免疫胶体金渗滤测试盒的最低检测限Fig.4 The lowest detection limit of DIGFA

图5 斑点免疫胶体金渗滤测试盒的重复性试验Fig.5 The repeatability assay of DIGFA

表1 斑点免疫胶体金渗滤测试盒的稳定性实验结果Tab.1 The stability of DIGFA for detection

图6 斑点免疫胶体金渗滤测试盒对于最低检测限的稳定性评价Fig.6 The stability evaluation on the lowest detection limit of DIGFA

2.3 斑点免疫胶体金渗滤测试盒的灵敏度试验按照制备的测试盒的操作步骤进行检测，将1 mg/ ml的 TDH 检测样本用 pH7.4，0.01 mol/L PB 溶液梯度稀释，确定DIGFA的最低检测限(图4)为250 ng/ml TDH。

2.4 斑点免疫胶体金渗滤测试盒的重复性试验每次样本检测均设置了3个平行对照，结果(图5)始终表现均一。

2.5 斑点免疫胶体金渗滤测试盒的稳定性试验在4℃和37℃两种保藏条件下，分别在保藏1、4、8、12、16周之后用于对250 ng/ml TDH的阳性样本进行检测，结果稳定性如(表1和图6)所示，明确肯定了该检测试剂盒最佳保存期为4℃密封条件下12周。

3 讨论

副溶血弧菌耐热直接溶血毒素TDH作为最主要的致病因子，对于广大热衷于海产品的民众的食品安全卫生而言直接产生了相当大的负面作用。虽然，国内已大量报道了副溶血弧菌的检测方法其中主要有PCR检测技术、ELISA检测技术等。检测时间也从6～8小时不等。Blackstone等[13]对致病性副溶血弧菌的TDH基因的设计了引物5′-AAA CAT CTG CTT TTG AGC TTCCA-3′＆5′-CTC GAA CAACAA ACA ATATCT CAT CAG-3′和 荧 光 探 针 5′-FAM-TGT CCC TTT(T)CC TGC CCCCGG-3′，建立了荧光实时PCR技术，对12种不同细菌株进行检测，结果表明仅含有TDH的副溶血弧菌产生了单个荧光信号，而不含TDH的弧菌或非弧菌菌株都无任何荧光反应，实验特异性强，灵敏度也高。窦勇等[6]以副溶血弧菌1.216 4作为抗原，免疫新西兰兔，获得效价为1.6×105的多克隆抗体;以此多克隆抗体作为一抗，山羊抗兔IgG-HRP作为酶标二抗，建立副溶血弧菌的间接ELISA快速检测法。但是，其方法的检测时间较长不能够满足快速在环境现场的或是临床的检测应用，不利于进行基层的推广使用。

因次，本文通过免疫学检测原理研制了斑点免疫胶体金渗滤法用来专一性检测TDH的快速检测盒，总耗时仅为3分钟。相对于目前针对TDH检测的已报道方法而言，在检测时间上达到了质的飞跃，此外，选用该法在检测试验中，步骤简便操作简单，不涉及任何仪器，只需通过肉眼的观察便可得出试验结果。同时该试剂盒最低检测限达到250 ng/ml TDH，还表现出了良好的稳定性与重复性，并在4℃恒温条件下保存12周后仍可以使用，无出现结果偏差。

目前，国内对于检测副溶血弧菌TDH的斑点免疫胶体金渗滤法开发的尚无报道，所以本文的研制为满足基层大批量在环境现场或是临床的快速检测上提供了可靠的工具。

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3 吴振龙，聂 军，鲍慧宁.副溶血弧菌直接溶血毒素65位色氨酸的突变[J].中华微生物学和免疫学杂志，2001;21(1):13-15.

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[收稿2011-11-20 修回2012-04-25]

(编辑 许四平)

Development of dot-immunogold filtration assay to detect TDH produced by Vibrio parahaemolyticus

YANG Jing-Ya，LU Xiao-Fan，WANG Zhen.Ocean Science Institution Research Institute，Shanghai Ocean University，Shanghai Engineering Center for Processing and Storage of Acquatic Product，Shanghai 201306，China

Objective:To develop a Dot immunogold filtration assay to especially detect TDH(thermostable direct hemolysin) produced by vibrio parahaemolyticus.MethodsT6D4 and T9H4 were coated to nanogold and ejected onto nitrocellulose filter membrane respectively.We developed the test kit via sandwich assay with double-antibodies，and analyzed its specificity，repeatablity and stability.ResultsThe DIGFA kit could especially detect TDH at the lowest level of 250 ng/ml.It also exhibited exact and stable testing result after 12 weeks later stored under 4℃.ConclusionThe study successfully developed the DIGFA kit，which could be widely applied into detect TDH rapidly on the scene.

Vibrio parahaemolyticus;Thermostable direct hemolysin;Dot immunogold filtration assay;Rapid detection

R392.12

A

1000-484X(2012)08-0733-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2012.08.013①本文为上海市科委工程中心建设项目(11DZ2280300)及上海市教育委员会重点学科建设项目(J50704)

杨靖亚(1976年-)，女，博士，副教授，主要从事海洋生物资源综合利用与海洋药物的开发、肿瘤药理学方面的研究，E-mail:jyyang@shou.edu.cn。

·实用临床免疫学·