及时检测孢子虫寄生挽救蜂群

及时检测孢子虫寄生挽救蜂群

近年来，我们这些从事蜜蜂工作的人，在养蜂实践上经历了重要的变化，保持蜜蜂健康似乎将蜂群常规管理转变成蜂群生存斗争。一些问题可以用新疾病或产生抗药性的微生物加以说明。在蜂巢内外增加应用合成的杀虫剂没有帮助，不同杀虫剂的混合（即便单独应用时它们对蜜蜂没有剧毒）能够影响蜜蜂的健康和免疫反应，产生不可预料的结果，使蜂群容易感染各种疾病。

由于正在受到丧失重要授粉者的威胁，美国国会批准增加蜜蜂研究经费，发现蜂群下降的原因。科学家正在寻找蜂群衰竭失调（CCD）综合征的根本原因，探索新疾病、有害化合物或危害蜂群的各种因素，以便使蜂群恢复健康。许多这样的紧迫问题将安排在美国农业部新的研究协作计划（CAP），系统地分析从定地蜂场采集的蜜蜂、花粉和蜂蜡。

被鉴定的可疑点如此之多，蜜蜂病毒和微孢子虫已经引起特别的关注。它们大部分是细胞内寄生，肉眼检查蜂群不能检测到。蜜蜂最终表现出疾病症状时，大部分蜜蜂被感染以致死亡，大多数情况下挽救蜂群已经太晚了。

至少在上世纪50年代，在美国就已经有蜜蜂微孢子虫，但是它出现在蜜蜂上是个混淆的问题。发现在蜂箱前爬行的染病蜂遗留下下痢的黄色带（粪便），通常使用抗生素治疗。为什么现在科学家对近年发生的蜂群损失怀疑微孢子虫？有的甚至指出蜜蜂微孢子虫是蜂群衰竭失调的主要原因。显然，微孢子虫的一个新种，东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）现在广泛分布在美国及全世界，悄悄地取代着蜜蜂微孢子虫（Nosema apis）。在1966年几乎没有被发现，但是在2005年观察到亚洲蜜蜂遭受这种疾病时重新引起关注。2006年，在欧洲检测到东方蜜蜂微孢子虫，使西班牙、法国、德国及瑞士的蜂群遭受到严重损失。因为这个新种在蜂场不容易检测，在不知不觉感染了好长时间。蜜蜂可能感染了几个星期不显示临床症状。这两种微孢子虫孢子在显微镜下观察非常相似，显微镜鉴定这个新种也是挑战。为了鉴定，蜜蜂样本通常送到能进行脱氧核糖核酸扩增的实验室，科学家采用聚合酶链反应（PCR）确定这两种微孢子虫的基因不同。感染东方蜜蜂微孢子虫的蜂群死亡非常迅速，蜂群生存取决于及时的检测和治疗。然而，等待实验室的结果丧失了宝贵的时间。因此，开发快速简单的检测工具，能够挽救整个蜂场，预防疾病的流行。

一、纤维素试纸测定

这种想法并不新鲜，是根据免疫学原理（抗体蛋白的相互作用）研制的。它们时常被设计成纤维素试纸的形式，以便在野外和家庭中使用。虽然，基于抗体的纤维素试纸测定是通过研发制成复杂的技术，实际的产品装备成一个试剂盒，使用方便。这种方法是在医学上应用，最熟悉的是人的妊娠试验。

为了使这种技术适应养蜂业的需要，将要开发一种简单无误的方法，检测蜜蜂样本中的微孢子虫感染。这项研究作为CAP的一部分正在美国农业部农业研究中心的蜜蜂研究室（HBRU）执行，将与私人生物技术公司合作。

二、试剂盒工作原理

试剂盒含有多条纤维素试纸，每一条使用一次。将压碎的蜜蜂或从多只蜜蜂解剖出来的中肠放入有试剂的玻璃瓶中，把一条纤维素插入匀浆里。过一会将出现一条或两条色带。如果只看到一条蓝色带（对照），见图1-1A（-）指示为阴性结果。如果看到两条带，指示为阳性结果，一条蓝色带为对照，另一条红色带指示目标微孢子虫蛋白质，见图1-1A（+）。

东方蜜蜂微孢子虫抗体（Ab）结合到纤维素条带上，作为一个“红旗”和一个为免疫原（微孢子虫蛋白质）的固位槽。免疫反应是微孢子虫抗体和微孢子虫蛋白质之间的非常强的结合（图1-1B）。微孢子虫孢子加入反应混合物中时，微孢子虫抗体将与微孢子虫蛋白质结合，形成非常牢固的带。如果这种反应采用第二抗体（抗体检测者）与颜色检测两者结合，则出现两条颜色带（对照和具体的微孢子虫）指示有微孢子虫孢子。显示一条颜色带（对照）指示阴性结果。

这种检测法的基本思想不是新的，从前许多人想开发这种测定方法。然而，主要的困难是，抗体质量不佳，缺乏特异性，敏感性差，阻碍成功地开发出一种快速的测试方法。抗体通常是通过将一种外来的蛋白质（免疫原）注射到山羊、兔子或老鼠等动物体内。动物的免疫系统检测到外来蛋白质的入侵，反应产生抗体。很明显，抗体的质量左右免疫试样的成败。抗体检测的好坏要看原来的免疫原的型式和纯度而定。

在实验室生产免疫原时，时间、努力和它的合成物需要的资源是巨大的。制造纯净的免疫原是个挑战。污染的分子可成为第二免疫原，结果抗体缺乏特异性。我们决定选择一种新方法，所谓的基因抗体技术（GAT）（图2）来避免这种错误。采用这种技术完全是关于免疫原的新思路。采用基因抗体技术，是将含有目标（在我们的例子是微孢子虫）脱氧核糖核酸序列编码蛋白质的一段环形的脱氧核糖核酸（质粒）注入动物，然后在动物体内（通过动物）直接产生纯的蛋白质，从而避免在实验室正常长度蛋白质的生产过程。在活体内表达的蛋白质被动物视为外来的入侵者，转而触发产生抗体并释放到动物血液中。

采用基因抗体技术的一个困难是首先需要知道蛋白质顺序。这有一系列阻碍，除非病原的基因组已经测序。很幸运，美国农业部正在给两种微孢子虫测序。我们将能够测定位于东方蜜蜂微孢子虫孢子壁的目标蛋白质的顺序（美国农业部农业研究中心贝尔茨维里蜜蜂研究室Dr.Jay Evans提供DAN顺序）。现在正在对蜜蜂样本测试新的东方蜜蜂微孢子虫抗体。至今我们的测试显示很高的抗体敏感性，在稀释1∶5000的粗蜜蜂匀浆能检测微孢子虫孢子，与商业生产的抗体（的灵敏度）相似。这种方法也能检测低量的孢子。采用常规的实验室凝胶方法，确定新抗体能在1000只无感染的蜜蜂中检测出1只感染蜜蜂。这种水平的敏感度能够在蜂群中检测非常低的感染率。

三、试剂盒的应用

这种测验不是要取代实验室通用的方法。不需要取代为处理大量样本设计的高生产率技术。它会帮助养蜂人、养蜂爱好者以及商业养蜂者在野外检测和监视疾病的进程。它能帮助养蜂人关于处理疾病做出理智的决定。最重要的是，这种新检测工具优点有：（1）能够减少不必要的治疗，降低抗生素的使用；（2）为管理者在处理国内外蜜蜂移动方面有一个新的做出决定的工具；（3）蜂王和笼蜂生产者可检测和监视他们的生产群微孢子虫水平。

黄文诚 译自《美国蜜蜂》杂志2010第1期