缺血再灌注大鼠脑表超氧阴离子产生的可视化检测

王勇，王春霞，姚长义，王运杰

（中国医科大学1.附属第一医院神经外科，沈阳 110001；2.附属第四医院眼科，沈阳 110005）

缺血再灌注大鼠脑表超氧阴离子产生的可视化检测

王勇1，王春霞2，姚长义1，王运杰1

（中国医科大学1.附属第一医院神经外科，沈阳 110001；2.附属第四医院眼科，沈阳 110005）

目的对缺血再灌注大鼠脑皮质区域超氧阴离子的产生进行可视化检测。方法 用MitoSOXTM（超氧阴离子荧光标记探针）标记大鼠脑表区域神经细胞，共焦点激光显微镜活体观察在缺血（10min）再灌注（30min）过程中，脑表区域O2-产生的情况。结果 缺血开始3min后，O2-产生开始增加，并一直持续到再灌注后10min停止增长。结论在缺血期及再灌注早期O2-生成增加，且动脉附近区域O2-产生量要多于其他区域。

缺血再灌注；前脑缺血；氧自由基；活体成像

脑缺血再灌注损伤在临床上非常多见。大量研究揭示自由基在缺血再灌注损伤机制中扮演着重要角色［1，2］，但此结论多建立在细胞实验及免疫组化研究等离体实验的基础上，关于自由基活体检测的报道则甚少［3，4］。本研究以SD大鼠为对象，通过4血管阻断法建立前脑缺血再灌注损伤模型，利用共焦点激光荧光显微镜活体观察自由基产生情况，以期建立一个自由基可视化检测平台。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

雄性Sprague-Dawley大鼠13只，9周龄，体质量250～300g，由中国医科大学实验动物部提供。将大鼠随机分为血流测定组（脑组织不染色，只对缺血再灌注脑表脑血流进行测定，n=5），缺血组（脑表脑组织荧光染色后，接受缺血再灌注，n=5）和对照组（脑表脑组织荧光染色后不接受缺血再灌注，n=3）。

1.2 方法

1.2.1 缺血模型制作：采用改良4血管阻断法（4-vessel occlusion，4-VO）制作大鼠全脑缺血再灌注损伤模型：闭塞两侧椎动脉，双侧颈总动脉安置血管阻断气囊，缺血时间10min，再灌注30min，缺血过程中进行体温、血压、心率等生命指标监测；缺血前行静脉血气分析。

1.2.2 脑血流测定：水合氯醛（400mg/kg）腹腔注射麻醉后，头架固定大鼠，暴露右侧颅骨，于Bregma点后3.6mm、中线旁开2mm处，开1个3mm直径骨窗，硬膜保持完整。应用激光多普勒血流测定仪（Advance Co Ltd，Tokyo，Japan） 监测脑血流变化情况。

1.2.3 MitoSOXTM脑表活体染色：开颅过程同上，小心剪开硬膜，将MitoSOX（5μmol/L；Invitrogen；Ex/Em=510/580nm）通过显微注射泵注射至皮层下3mm，注射泵气压 0.1bar，推注时间 0.1s［5］，在荧光染剂孵育30min后，用生物胶结合载玻片封闭骨窗，骨窗下用人工脑脊液填充。

1.2.4 O2-分子活体成像：使用的正立显微镜（B X50WI，Olympus，Japan）装配有共焦点扫描系统（CSU-21，Yokogawa，Japan），相机（C2400，Hamamatsu Photonics，Japan）， 信 号 放 大 器（C2400-21SV，Hamamatsu Photonics，Japan），10倍水镜观察。缺血前5min开始基线采集，缺血10min，再灌注30min，观察时间共45min。每30s采集图像1次，共计 90张。采用 A quaCosmos software（Hamamatsu Photonics，Japan）软件分析图像。

1.3 统计学分析

统计学分析软件为SPSS 10.0，组间比较方法为t检验或单因素方差分析，P<0.01为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑血流测定

缺血组与对照组之间，缺血前血气结果无差异。4血管被阻断后，脑表血流量能下降至正常基线的（20±10）%；撤销阻断后，脑血流迅速恢复并产生1个一过性过灌注峰［（110±10）%］，过灌注维持 2～3min后，血流再次回复到基线水平（图1）。

2.2 脑表MitoSOXTM的荧光变化

缺血时，观测到观察窗内MitoSOXTM的荧光强度上升到（160±10）%，再灌注时继续上升至（182±11）%（图2）。进一步对脑表各个部位进行图像分析，发现动脉附近区域荧光上升最高为（222±13）%，富含毛细血管床区域为（162±7）%。提示O2-的产生具有部位特异性（图3）。

3 讨论

在缺血再灌注过程中会有大量的自由基产生，进而引发一系列病理变化，最终导致神经细胞功能障碍乃至死亡。但对自由基的检测一直限于细胞实验、免疫组化研究等离体实验水平，活体水平检测报道甚少。电子自旋共振谱 （electron spin-resonance spectroscopy，ESR）、自旋捕集和微量渗析等技术因操作复杂、费用高昂，普及受限。上述方法均非即时检测，无法把握稳定性极差的自由基的实际产生［6～8］。鉴于此，本研究拟采用活体成像技术，建立一个自由基可视化检测平台。

MitoSOXTM是一种新型的自由基荧光探针，能高效率的渗透过细胞膜，进入线粒体内，高选择的与O2-超氧阴离子结合，发出红色荧光。但是与Fluo-2，Fluo-3等钙离子螯合剂不同，MitoSOXTM被氧化后无法再解离，所以MitoSOXTM荧光增强说明O2-生成增加；MitoSOXTM荧光无变化说明O2-生成无增加。另外，我们采用的是气动显微注射染色法，可以使荧光染剂在最短的时间内扩散到皮层脑组织内，减少了孵育时间及荧光褪色。

在活体成像研究中，脑搏动（随着呼吸、心跳）对图像采集影响非常大。我们采用了透明闭合骨窗及骨窗下人工脑脊液填充的方法，最大程度地减少了脑搏动，保持观察范围内焦点及景深的稳定。通过闭合骨窗的载玻片，光镜下可以在解剖学上区分动静脉及毛细血管区，对比荧光像可以对比不同区域的荧光变化。

本研究结果提示，在缺血期及再灌注早期O2-大量产生，这与国内外相关研究结果一致［4，8］。我们利用活体成像技术对脑表不同区域的自由基产生进行了可视化分析，结果提示在动脉周围区域O2-产生要远远多于其他区域。其原因可能是：（1）动脉附近氧浓度高，O2-产生所必需的原料充足；（2）黄嘌呤氧化酶在内皮细胞中大量表达，该酶能促进O2-的形成［9］。

本研究中我们对经典的4-VO法做了部分改良，采用可充气球囊压迫颈总动脉代替了以往的尼龙绳牵拉法。有效降低了因术者牵拉尼龙线力度过大而导致血管壁损伤断裂出血或因牵拉力量不足导致缺血效果不确实等情况的发生。脑血流测定结果也提示改进后的缺血模型在缺血强度上与经典方法接近。

本研究初步确立了一种活体成像自由基检测新方法，确立了小动物脑组织活体自由基检测平台。通过更换荧光探针，对脑表其他信号传导，如其他自由基、钙离子变化及膜电位变化等进行可视化检测，因此具有广阔的应用前景。

［1］Floyd RA，Carney JM.Free radical damage to protein and DNA：mechanisms involved and relevant observations on brain undergoing oxidative stress［J］.Ann Neurol，1992，32（Suppl）：S22-S27.

［2］Halliwell B.Reactive oxygen species and the central nervous system［J］.J Neurochem，1992，59（5）：1609-1623.

［3］Phillis JW，Sen S.Oxypurinol attenuates hydroxyl radical production during ischemia/reperfusion injury of the rat cerebral cortex：an ESR study［J］.Brain Res，1993，628（1-2）：309-312.

［4］Zini I，Tomasi A，Grimaldi R，et al.Detection of free radicals during brain ischemia and reperfusion by spin trapping and microdialysis［J］.Neurosci Lett，1992，138（2）：279-282.

［5］Stosiek C，Garaschuk O，Holthoff K，et al.In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100（12）：7319-7324.

［6］Tarpey MM，Wink DA，Grisham MB.Methods for detection of reactive metabolites of oxygen and nitrogen：in vitro and in vivo considerations［J］.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2004，286（3）：R431-R444.

［7］Zini I，Tomasi A，Grimaldi R，et al.Detection of free radicals during brain ischemia and reperfusion by spin trapping and microdialysis［J］.Neurosci Lett，1992，138（2）：279-282.

［8］Sakamoto A，Ohnishi ST，Ohnishi T，et al.Relationship between free radical production and lipid peroxidation during ischemia-reperfusion injury in the rat brain［J］.Brain Res，1991，554（1-2）：186-192.

［9］Betz AL.Identification of hypoxanthine transport and xanthine oxidase activity in brain capillaries［J］.J Neurochem，1985.44（2）：574-579.

（编辑王又冬，英文编辑刘宝林）

Superoxide Radical Production in Rat Ischemic Brain Measured by Intravital Fluorescence Imaging

WANG Yong1，WANG Chun-xia2，YAO Chang-yi1，WANG Yun-jie1
（1.Department of Neurosurgery，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Ophthalmology，The Fourth Affiliated Hospital，China Medical University，Shenyang 110005，China）

ObjectiveWe examined reactive oxygen species （ROS）generation on cerebral ischemia/reperfusion rats by intravital fluorescence imaging.MethodsIn anesthetized adult rats，MitoSOX （a fluorescent dye for superoxide radical） was injected into cortices by a pressurized bolus.Through a closed cranial window，fluorescent images were taken with a confocal microscope on 10-minute forebrain ischemia and 30-min reperfusion.ResultsIn ischemia and the early period of reperfusion，the MitoSOX fluorescence intensity significantly increased to 183%，and these increases were significant in the areas adjacent to the arteries.ConclusionO2-production increased in ischemia and the early period of reperfusion period.The O2-production was location-selective，being significant in the areas adjacent to the arteries.This method was useful for investigating intracellular in situ ROS production.

cerebral ischemia and/or reperfusion；in vivo imaging；oxidative stress

R743.3

A

0258-4646（2012）01-0018-03

doiCNKI：21-1227/R.20120113.1028.026

http：//www.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20120113.1028.026.html

国家自然科学基金青年科学基金资助项目（81000565/H0914）

王勇（1975-），男，主治医师，博士.E-mail：wangyong@mail.cmu.edu

2011-07-04

网络出版时间：2012-01-1310：28