米氮平对抑郁症大鼠海马凋亡相关蛋白表达的调节作用

孙晓红，孟秀君，徐枫，董玉霞，何悦，侯琳琳

（中国医科大学 1.附属第四医院神经内科，沈阳 110032；2.第95期临床医学系，沈阳 110001）

米氮平对抑郁症大鼠海马凋亡相关蛋白表达的调节作用

孙晓红1，孟秀君1，徐枫2，董玉霞1，何悦1，侯琳琳1

（中国医科大学 1.附属第四医院神经内科，沈阳 110032；2.第95期临床医学系，沈阳 110001）

目的研究米氮平对抑郁症大鼠模型学习记忆、海马凋亡蛋白Caspase-3和凋亡抑制蛋白Bcl-2异常表达的调节作用。方法 将20只大鼠随机分为对照组、抑郁组和治疗组，制备抑郁症模型及米氮平治疗模型，采用Morris水迷宫实验方法评价学习记忆，应用蛋白免疫印迹杂交方法分析海马Caspase-3蛋白和Bcl-2蛋白表达变化。结果 与对照组比较，抑郁组大鼠在水迷宫实验目标象限内游动时间显著减少（P＜0.01），海马Caspase-3蛋白表达水平显著增高（P＜0.05），Bcl-2蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。治疗组大鼠在水迷宫实验目标象限内游动时间较抑郁组增加，海马Caspase-3蛋白表达水平较抑郁组降低，Bcl-2蛋白表达水平较抑郁组升高（P均<0.05）。结论抑郁症大鼠学习记忆力下降、海马Caspase-3蛋白异常高表达、海马Bcl-2蛋白异常低表达，米氮平使抑郁症大鼠学习记忆力、海马Caspase-3蛋白表达、海马Bcl-2蛋白表达逆转。

米氮平；海马；Caspase-3；Bcl-2

抑郁症发病率逐年提高，对抑郁症发病机制及治疗方法的研究将有助于减轻社会负担，改善人群生存质量。抑郁症患者尸检研究提示海马等脑功能区存在结构及功能改变［1］。最新研究发现，除了诱导神经元凋亡的功能外，凋亡蛋白Caspase-3是神经元突触长时程抑制诱导所必需的［2］。本实验通过构建抑郁症大鼠模型，研究抑郁症大鼠学习记忆和海马中参与神经元存活和突触可塑性调节的凋亡蛋白Caspase-3及其抑制蛋白Bcl-2的表达变化，研究米氮平这种具有5-羟色胺和去甲肾上腺素双重再摄取抑制作用的新型抗抑郁药对其产生的调节作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

20只雌性成年SD大鼠，体质量180～200g，清洁级，由中国医科大学实验动物中心提供。大鼠自由进食水、常温、正常昼夜节律下饲养1周以适应环境。用数字表法随机分为3组：对照组（n=4）、抑郁组（n=8）和治疗组（n=8）。

1.2 模型制备

对照组大鼠合养，不给予任何应激刺激和药物治疗。抑郁组和治疗组大鼠孤养，并给21d慢性不可预见性应激刺激［3］，包括束缚应激、斜笼 30°、昼夜颠倒、禁食、禁水、夹尾5min、湿垫料、冰水游泳10min等。给予慢性应激刺激的同时，抑郁组大鼠每日口饲生理盐水（2mL/kg），治疗组大鼠每日口饲米氮平盐溶液（2mL/kg）。米氮平标准品，由华裕制药有限公司提供。

1.3 Morris水迷宫实验

造模18～21d，进行Morris水迷宫（Morris water maze，MWM）实验测试大鼠空间学习及记忆能力。MWM是一个内壁黑色，直径150cm、高50cm的圆形水池，水温（26±1）℃。水池分为 SW、NW、SE 和NE 4个象限，NE象限正中放置1个透明平台，平台顶距水面1cm。迷宫上方安装有摄像头，同步记录大鼠游动轨迹。实验历时5d［4］，第1天为训练适应过程；第2、3、4天将大鼠面向池壁入水，记录120s内大鼠寻找并爬上透明平台所需时间即逃避潜伏期；第5天，撤走平台，记录120s内大鼠穿越平台所在位置的次数及在NE象限内游动时间（用游动时间/总时间表示）。

1.4 Western blot检测

MWM实验12h后用戊巴比妥经腹腔深麻醉，断头取脑，于冰上快速剥离海马组织，提取蛋白，采用Bradford法定量蛋白浓度。采用Western blot方法检测大鼠海马组织Caspase-3和Bcl-2蛋白的表达量，每孔上样量为50μg，进行12%SDS-PAGE凝胶电泳、转膜，室温封闭1h，加入一抗浓度分别为1/300和1/200，4℃过夜，洗膜，加入HRP标记的山羊抗兔IgG作用2h，ECL显色，发光成像仪取像。以β-actin蛋白做为内参校正Caspase-3和Bcl-2蛋白表达量。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 MWM实验结果

实验第5天，大鼠穿越透明平台的次数组间无统计学差异（P＞0.05）。大鼠在NE象限内游动时间对照组（0.46±0.01）、抑郁组（0.19±0.01）和治疗组（0.35±0.05）组间存在统计学差异（P＜0.01）。多重比较发现抑郁组大鼠在NE象限游动时间较对照组减少，差异有统计学意义（P＜0.01）；治疗组大鼠在NE象限内游动时间较抑郁组增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；而治疗组和对照组间无统计学差异（P＞0.05）。提示抑郁症模型大鼠学习记忆受损，而米氮平治疗改善大鼠在水迷宫实验中的行为表现。

2.2 Western blot检测结果

Western blot检测结果见图1，单因素方差分析显示组间有统计学差异（P＜0.05）。多重比较发现抑郁组海马Caspase-3蛋白相对表达量高于对照组和治疗组，差异有统计学意义（P＜0.05），抑郁组海马Bcl-2蛋白相对表达量低于对照组和治疗组，差异有统计学意义（P＜0.05），而对照组和治疗组间海马Caspase-3和Bcl-2蛋白相对表达量无统计学差异（P＞0.05），见表1。提示抑郁症模型大鼠凋亡相关蛋白异常表达，米氮平治疗则可逆转这种异常表达。

表13组C a s p a s e-3和B c l-2蛋白表达比较（±s）T a b.1N o r ma l i z e dl e v e l s o f c a s p a s e-3a n db c l-2p r o t e i ni nt h er a t h i p p o c a mp i（±s）Group Caspase-3expression Bcl-2expression Control group 0.87±0.01 1.38±0.02Depression group 1.10±0.071），2） 0.88±0.131），2）Treatment group 0.92±0.06 1.21±0.021）P ＜ 0.05vs control group；2）P ＜ 0.05vs treatment group.

3 讨论

本实验结果显示，米氮平治疗后大鼠在水迷宫实验中的抑郁样行为明显改善，显示出对异常高表达的Caspase-3蛋白和低表达的Bcl-2蛋白具有调节作用。

近年来，临床研究发现抑郁症患者有不同程度海马依赖的记忆功能受损表现［5］。本实验结果发现，抑郁组大鼠在NE象限游动时间较对照组减少，差异有统计学意义（P＜0.01），提示抑郁组大鼠学习记忆受损，可能由于海马参与短期记忆的形成以及短期记忆到长期记忆的转换受到抑制［6］，而治疗组和对照组间无统计学差异（P＞0.05），提示米氮平治疗对海马记忆功能有一定的改善作用。

另有临床研究发现，抑郁症患者出现海马萎缩，可能与神经元凋亡、树突重构有关［7］。Caspase-3蛋白及其活性形式存在于海马正常神经元内，为神经元长时程抑制诱导所必需，介导快速兴奋性突触传递［2］。Caspase-3蛋白的DNA片段在抑郁症患者海马内表达增加［8］。提示海马内高表达的Caspase-3蛋白可能通过可塑性途径参与海马萎缩及树突棘丢失。

Bcl-2蛋白有抑制凋亡蛋白活性的作用［3］，对神经元具有类似神经营养因子的保护作用［9］。本实验结果显示：抑郁组海马Bcl-2蛋白表达量低于对照组和治疗组，差异有统计学意义（P＜0.05），而对照组和治疗组间海马Bcl-2蛋白表达量无统计学差异（P＞0.05），与文献报道的抑郁症大鼠模型中海马Bcl-2mRNA表达下降，抗抑郁治疗上调海马Bcl-2蛋白免疫杂交量的结论［10］一致。

综上所述，我们认为Caspase-3蛋白高表达而Bcl-2蛋白低表达，可能是引起海马结构和功能改变的原因之一，而治疗组海马Caspase-3和Bcl-2蛋白表达与对照组无统计学差异，提示抗抑郁药可能影响细胞凋亡的Caspase-3和Bcl-2蛋白表达，促进神经纤维网的修复。

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（编辑武玉欣，英文编辑刘宝林）

The Effects of Mirtazapine on the Expression of Hippocampal Apoptotic Proteins in the Rat Depression Model

SUN Xiao-hong1，MENG Xiu-jun1，XU Feng2，DONG Yu-xia1，HE Yue1，HOU Lin-lin1
（1.Department of Neurology，The Fourth Affiliated Hospital，China Medical University，Shenyang 110032，China；2.The 95th Class，Faculty of Clinical Medicine，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the effects of mirtazapine on learning and memory and on the expression of hippocampal Caspase-3and Bcl-2protein in rat depression model.MethodsRats were divided into control，depression and treatment group.Depression model and mirtazapine treatment model were prepared，followed by Morris water maze test to evaluate learning and memory，and western blot to assess hippocampal Caspase-3and Bcl-2protein expression.ResultsRats in the depression group showed significantly reduced swim time spent in the targeted quadrant of the morris water maze，elevated Caspase-3protein levels，and decreased Bcl-2protein levels.ConclusionDepression model rats showed impaired learning and memory，abnormal expression of hippocampal Caspase-3and Bcl-2protein，while mirtazapine attenuated the abnormalities.

mirtazapine；hippocampi；Caspase-3；Bcl-2

R341.32

A

0258-4646（2012）01-0008-03

doiCNKI：21-1227/R.20120113.1027.023

http：//www.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20120113.1027.023.html

国家自然科学基金资助项目（30700220）；辽宁省教育厅高校科研计划（L2010587）；辽宁省博士启动基金项目（20081057）

孙晓红（1972-），女，教授，博士后.E-mail：sunxiaohong1972@hotmail.com

2011-07-14

网络出版时间：2012-01-1310：27