联合应用bFGF和维甲酸诱导hUCMSCs向神经元分化的实验研究

刘学元，李德华，单 伟，姜 东

(辽宁医学院，辽宁锦州121001)

通过组织工程技术体外分离和培养的干细胞可用于神经系统疾病的细胞替代治疗。由于干细胞属于高度未分化的原始细胞，植入宿主体内后受微环境因素的影响，致瘤的风险较大，有必要在移植前定向诱导成神经细胞。目前已能将神经干细胞、胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞等诱导成神经元，常用的诱导剂包括二甲基亚砜、β-巯基丙醇、丹参、内皮细胞生长因子、神经生长因子、神经营养因子等［1，2］，但单独或联合应用维甲酸(RA)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)体外诱导人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)定向分化为神经元的研究尚少见报道。我们于2010年8月～2011年3月进行实验，探讨在RA和bFGF各自单独应用及联合作用下，hUCMSCs向神经元分化的潜能和条件，为其进一步的临床应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 hUCMSCs由天津国家干细胞中心惠赠。

1.2 主要试剂和仪器设备 DMEM/F12、胎牛血清、0.25%胰酶(Hyclone公司)，RA、bFGF(Sigma公司)，鼠抗人Nestin单克隆抗体、兔抗人胶原纤维酸性蛋白单克隆抗体、HRP标记的羊抗兔/鼠IgG多聚体(Santa Cruz公司)，兔抗人β-TubulinⅢ单克隆抗体(BG公司)。CO2恒温孵育箱(SIM公司)，超净工作台(苏州净化设备有限公司)，OLYMPUS显微镜及照相系统(Olympus公司)。

1.3 方法

1.3.1 hUCMSCs培养及传代 纯化的hUCMSCs在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下用DMEM/F12培养液(含10%胎牛血清)培养，在对数生长期进行传代。

1.3.2 hUCMSCs的诱导分化 取传至第3代的hUCMSCs，待细胞融合至70%～80%后，接种于6孔培养板中。依次加入不同诱导剂进行实验分组:空白对照组不加任何诱导剂，RA组加入0.5 μg/mL RA，bFGF组加入20 ng/mL bFGF，RA+bFGF组加入0.5 μg/mL RA和20 ng/mL bFGF。空白对照组和bFGF组接种细胞密度分别为5×105/mL、2.5× 105/mL，RA组和RA+bFGF组接种细胞密度为1× 106/mL，在第12天进行下列指标的检测。

1.3.3 观察细胞形态变化 用倒置显微镜在100倍和200倍视野下观察细胞在诱导前和诱导后形态的变化。

1.3.4 免疫细胞化学检测Nestin、β-TubulinⅢ和GFAP的表达情况 各组细胞用10%的甲醛固定30 min，用PBS洗3次、3 min/次。3%H2O2溶液处理30 min以去除内源性过氧化物酶，PBS洗涤3次、5 min/次。分别滴加1∶200稀释的鼠抗人Nestin单克隆抗体、兔抗人 β-TubulinⅢ单克隆抗体、兔抗人GFAP单克隆抗体，4℃孵育过夜，PBS洗涤3次、5 min/次;分别滴加HRP标记的羊抗兔/鼠IgG多聚体，37℃孵育30 min，PBS洗涤3次、5 min/次;DAB显色;苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封片。用PBS代替一抗作为阴性对照。每组随机选取8个视野在200倍视野记录阳性细胞数量和视野内细胞总数，阳性比率R=(阳性细胞数N1/视野总细胞数N2)×100%，比较各视野中阳性细胞比率R，所有实验重复3次。

1.3.5 统计学方法 采用SPSS13.0软件进行统计处理，数据以±s表示，采取方差分析和q检验，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 hUCMSCs诱导前后形态学观察 诱导前的纯化细胞贴壁生长，呈长梭形，细胞密度低时为扁平单层细胞，密度增加趋于融合时，细胞形态变得细长，类似成纤维细胞，呈漩涡状生长。诱导后空白对照组和bFGF组形态变化不明显，RA组和RA+bFGF组的细胞胞质以胞核为中心收缩，部分胞质收缩形成细胞的突起，突起之间有网状连接，具有典型的神经元样形态;少量细胞死亡，脱落呈圆球型的漂浮细胞。见插页Ⅳ图14。

2.2 Nestin、β-TubulinⅢ和GFAP的表达 见表1，插页Ⅳ图15～17。

表1 各组细胞在处理12 d时各抗体的阳性细胞百分比(%)

3 讨论

bFGF是促进有丝分裂的因子，可调节体外培养的干细胞的分裂增殖，维持其处于干细胞的状态。Tassi等［3］认为，bFGF先后与细胞表面低亲和力、高亲和力bFGF受体结合，完成细胞内外的信息传递而发挥其生物学活性作用。RA是维生素A在体内的衍生物，主要通过细胞内受体RAR和RXR调节基因活性。在脊椎动物胚胎和神经系统发育中发挥重要作用，不仅决定了胚胎头尾轴建立、神经板及神经管的模式形成、神经元的分化和成体神经轴突的再生，还参与了前中后脑和脊髓的分化。当缺乏RA信号时，后脑尾段将无法形成，脊髓前段的发育也将受到影响［4］。在体外，已有学者联合应用RA和bFGF等将脂肪干细胞、羊膜上皮细胞、胎盘干细胞、肌源性干细胞等诱导成神经元，另有研究者应用二者将神经干细胞诱导成施万细胞、将胚胎干细胞诱导成分泌胰岛素的细胞等［5］。

本实验结果表明，bFGF组中神经前体细胞的标记Nestin、神经元标记 β-TubulinⅢ的阳性率为3.52%和2.87%，与空白组无明显差异，说明bFGF单独作用对hUCMSCs向神经前体细胞分化和神经元的形成作用甚微。在预实验中发现，bFGF组和空白组由于细胞生长迅速，若与其他两组接种浓度一样，在诱导后第6、10天后由于细胞密度过大，分别出现了细胞脱片现象，这也说明bFGF是促进细胞分裂的有力因子。为了观察hUMSCs诱导后12 d细胞的形态及检测指标，将这两组接种密度调整为其他两组的1/4和1/2。RA组β-TubulinⅢ的阳性率为49%，说明RA可促进hUMSCs向神经前体细胞和神经元分化，bFGF+RA组β-TubulinⅢ的阳性率为72%，二者间有显著差异，由此推断bFGF可以促进RA对hUCMSCs的作用，使其分化率增高，原因可能是bFGF可以促进RA的细胞内外信号传导而发挥协同作用。各组神经胶质细胞的标记GFAP均低表达，诱导率无差异，说明bFGF和RA对hUMSCs向神经胶质细胞的分化作用不大。

自2003年Mitchell等［6］提出人脐带华尔通氏胶来源的基质细胞具有多能干细胞特性后，由于hUCMSCs含量相对丰富，体外增殖潜能高，并且具有较低的免疫原性，无伦理道德问题等，受到越来越多的关注。已有研究者将其诱导为内胚层来源的胰岛β样细胞和肝细胞，中胚层来源的成骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞和精原细胞等，外胚层来源神经细胞等［7，8］。本实验在体外联合应用bFGF和RA诱导hUCMSCs为神经元并有较高的分化率，为神经元的移植提供了一种新的思路。在实验中虽然检测到了神经元特异性标志蛋白β-TubulinⅢ的表达，但诱导后的细胞的电生理特性、神经递质合成和分泌、移植后能否与宿主的神经细胞形成突触联系以完成生理功能等尚需进一步的研究。

［1］Zhang L，Zhang HT，Hong SQ，et al.Cografted Wharton’s jelly cells-derived neurospheres and BDNF promote functional recovery after rat spinal cord transaction［J］.Neurochem Res，2009，34 (11):2030-2039.

［2］Hu BY，Zhang SC.Directed differentiation of neural-stem cells and subtype-specific neurons from hESCs［J］.Methods Mol Biol，2010，636:123-137.

［3］Tassi E，Al-Attar A，Aigner A，et al.Ehancement of fibroblast growth factor(FGF)activity by an FGF-binding protein［J］.J Biol Chem，2001，276(43):40247-40253.

［4］Maden M.Retinoic acid in the development，regeneration and maintenance of the nervous system［J］.Nat Rev Neurosci，2007，8 (10):755-765.

［5］Niknejad H，Peirovi H，Ahmadiani A，et al.Differentiation factors that influence neuronal markers expression in vitro from human amniotic epithelial cells［J］.Eur Cell Mater，2010，19:22-29.

［6］Mitchell KE，WeissML，Mitchell BM，et al.Matrix cells from Whartonps jelly form neurons and glia［J］.Stem Cells，2003，21(1): 50-60.

［7］PereiraWC，Khushnooma I，MadkaikarM，et al.Reproducible methodology for the isolation ofmesenchymal stem cells from human umbilical cord and its potential for cardiomyocyte generation［J］.J Tissue Eng Regen Med，2008，2(7):394-399.

［8］Chao KC，Chao KF，Fu YS，et al.Islet-like clusters derived from mesenchymal stem cells in Wharton’s Jelly of the human umbilical cord for transplantation to control type 1 diabete［J］.PLoS One，2008，3(1):e1451.