苦瓜多糖提取工艺的考察与优化

杨 税，张雅琴，孙 锋，张学农

(1.苏州大学药学院，江苏苏州215123;2.苏州卫生职业技术学院，江苏苏州215009)

苦瓜为葫芦科苦瓜属植物，是人们生活中的一种很常见的蔬菜，同时也是功能食品的原料，素有“药用蔬菜”之称。苦瓜味苦性寒，无毒，其根、茎、叶、花、果实和种子在世界各地均有药用记载，《本草纲目》记载苦瓜有清火明目、解毒、降血糖、滋养、益气的功效［1，2］。据文献报道［3］，通过沸水提取、醇析、脱蛋白和透析，可以从鲜苦瓜中分离出多糖粗品，这种多糖称为苦瓜多糖(Momordica charantia polysaccharide，简称MCP)，是一种由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成的杂多糖，具有水溶性，能提高免疫力、降血糖、抑菌、抗氧化等，是苦瓜中主要生物活性成分之一。

鉴于苦瓜多糖的多种功效及苦瓜的药用价值，本文以苦瓜为原料，通过综合影响提取的单因素和多因素设计实验，考察其最佳的提取条件，并建立新的优化工艺，以提高苦瓜多糖的提取效率。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 SHZ－D循环水式真空泵(河南巩义市英峪豫华仪器厂);112GKC控温水浴锅(上海苏达实验仪器有限公司);MS－DS10A1豆浆机(广东省精品电器制造有限公司); TU－1800紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。

1.2 材料和试剂 苦瓜:市售，来自苏州蔬菜农贸市场。无水乙醇、常用水、葡萄糖、浓硫酸以及蒽酮试剂等。

2 方法与结果

2.1 提取工艺的流程 挑选饱满苦瓜去籽去瓤，洗净切片后分别称取苦瓜100 g，按实验要求加入一定量的水进行匀浆，将苦瓜浆倒入不同规格的圆底烧瓶中，分别加入3 g超滤酶和1 g果胶酶，摇匀，浸提一定时间后冷却，直至常温，抽滤，残渣继续加水10 mL保持原条件浸提2次，再次过滤，合并滤液，并浓缩至约50 mL，冷却后加入木瓜蛋白酶1 g，摇匀后45℃恒温1 h，冷却至常温加入5倍体积的无水乙醇，摇匀密封后放置冰箱48 h，过滤收集沉淀，在50℃烘箱中放置12 h，得到苦瓜多糖产品，称重，最后进行苦瓜多糖的含量测定。

2.2 影响因素考察 以苦瓜浆为原料，采用热水浸提、乙醇醇析的方法提取苦瓜多糖，影响苦瓜多糖提取的主要因素有:浸提温度、时间、水料比、乙醇沉淀浓度、酶的选择和用量等。因此，本实验以浸提温度、水料比、浸提时间为3个考察因素，通过综合提取效率的单因素变化规律和多因素的相互干扰以确定最终的试验条件。

2.2.1 浸提温度的影响 固定水料比为1∶1、浸提时间为3 h，浸提温度分别以60、80、100、120℃进行试验，结果如图1。

图1 产量与浸提温度关系图

2.2.2 浸提时间的影响 条件:固定温度为60℃、水料比为1、浸提时间分别以1、3、5、7 h进行试验，结果如图2。

图2 产量与浸提时间关系图

2.2.3 水料比的影响 条件:固定浸提温度为60℃、浸提时间为3 h，水料比分别以1(1∶1)、5、10、20进行试验，结果如图3。

图3 产量与水料比的关系图

由图1、图2和图3可见，苦瓜多糖产量与浸提温度、浸提时间以及水料比有密切的关系，通过曲线的变化规律可看出产量随浸提温度升高先增大然后渐渐平缓并向下的趋势;产量随浸提时间的增加有先降低后渐渐平缓并有略微向上的趋势，但变化不大;而产量随水料比的增加先平缓略微向下后上升再趋于平稳。所以根据单因素的影响以及实验的实际操作的可行性角度出发，除空白列外另选三因素:浸提温度、浸提时间和水料比，同时各取3个水平，进行L9(3)正交试验［4］，其中:浸提温度取60、80、100℃;水料比取1、5、10;浸提时间取1、2、3 h;通过实验测定确定苦瓜多糖的提取率及其多糖含量。具体的设计见表1。

表1 试验因素水平设计表

2.3 实验步骤 根据试验因素水平设计表按照优化后提取工艺的流程分别进行试验。

3 实验结果

3.1 苦瓜多糖的产量 通过L9(34)正交试验设计表按照优化后提取工艺的流程进行试验，试验结果见表2。

表2 正交设计试验结果

3.2 苦瓜多糖含量测定

3.2.1 原理及方法 苦瓜多糖的含量测定通常依靠糖类物质的特征颜色反应。常用的试剂很多，就反应的化学过程来说，可以概括为两种不同的类型:①用非氧化性酸(硫酸或盐酸)使糖类脱水形成呋喃醛类衍生物，进一步与酚类或含氮碱缩合生成有色物质;②用碱处理糖类，产生复杂的裂解衍生物，即运用与某些试剂作用，呈现特殊颜色。目前常用的多糖含量测定方法为蒽酮－硫酸法，是以第一类原理为基础，利用多糖在浓硫酸作用下水解成单糖，单糖进一步脱水成糖醛，糖醛与蒽酮直接结合生成蓝绿色衍生物，该衍生物在620nm处出现最大吸收。该操作具有简单、快速、试验现象稳定、重现性较好等优点［5］。本实验中以葡萄糖作为标准品，采用蒽酮－硫酸法分析测定苦瓜多糖的含量。

3.2.2 葡萄糖标准曲线绘制 取9支带塞磨口试管，用浓度为0.5 g·L－1葡萄糖标准溶液分别配制含糖量(mg· mL－1)为0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20、0.22的葡萄糖溶液。称取0.33 g蒽酮，加100 mL浓硫酸，置于棕色瓶中，摇匀。分别移取1 mL系列葡萄糖标准溶液于磨口试管中，同时以1 mL蒸馏水作空白，每管加入4.00 mL蒽酮－硫酸试剂，立即摇匀，置于冰水浴中，然后置于沸水浴中加热10 min，用自来水冷却，室温放置10 min，于620 nm处测定吸光度。并且以吸光度为纵坐标，葡萄糖的含量为横坐标，绘制标准曲线［6］(图4)。

3.2.3 苦瓜多糖含量测定与分析 分别取1 mg浸提产品分别标号定量至1 mL，测量其吸光度;结果如下:

图4 吸光度与糖含量的标准曲线

表3 多糖含量、多糖量与吸光度的关系

将表3中的苦瓜多糖产品量以及苦瓜多糖含量代人L9(34)正交试验表进行分析，推导出优化工艺中的最佳实验条件。

表4 正交设计试验结果

表5 L9(34)正交试验方差分析表

通过L9(3)正交试验表结果和方差分析表确定影响多糖提取率的因素B(浸提温度)、因素C(水料比)、因素D(浸提时间)的主次关系，结果如下:①由极差R值大小分析结果为RD＞RC＞RB，即影响产品产率的因素主次顺序:D＞C＞B;②根据显著性可知:FD＞FC＞FB，影响产品产率的因素主次顺序:D＞C＞B。由此可见，根据正交实验结果和方差分析都得出影响产品产率的因素主次顺序为D＞C＞B。同时，每个因素在不同水平上对多糖提取率的影响程度分别为D1＞D2＞D3，C3＞C1＞C2，B2＞B3＞B1［7］，所以，苦瓜多糖提取率的最优水平搭配为D1C3B2，即时间为1 h、水料比为10∶1、浸提温度为80℃。此时的苦瓜多糖产品的提取率为3.3%，多糖含量为23.2%，这也与实验结果相符。

4 结论

苦瓜多糖的提取方法到目前为止已有很多，近期研究比较多的运用苦瓜干进行提取比如有常规法、超声波提取法、微波萃取法等［8］。而本试验通过运用苦瓜浆，采用酶解法提取水溶性苦瓜多糖，工艺步骤少，试验条件温和，减少了苦瓜中有效成分的损耗，同时多糖的产量与含量也有所提高，本实验通过工艺的优化也为以后苦瓜多糖提取的进一步探索提供了一些依据。

［1］ 田亚维.苦瓜的研究概述［J］.医学信息，2002，10 (15):619－620.

［2］ 陈红琳.苦瓜的药理作用［J］.中华医学写作杂志，2002，9(18):1504－1505.

［3］ 程霜，崔庆新，王勇.水溶性苦瓜多糖的提取与测定［J］.郑州粮食学院学报，2000，21(2):53－56.

［4］ 王钦德，杨坚.食品试验设计与统计分析［M］.北京:中国农业大学出版社，2003:85－120.

［5］ 高晓明.苦瓜有效成分的提取、纯化工艺研究［D］.西安:西北大学，2006.

［6］ 谢建华，谢明勇，聂少平，等.青钱柳中多糖的测定［J］.分析试验室，2007，26(8):32－36.

［7］ 刘金福，张平平，赵鑫，等.苦瓜多糖提取工艺的研究［J］.天津农学院学报，2003，10(3):30－34.

［8］ 钟正.苦瓜多糖研究综述［J］.广东化工，2011，38(2): 91－92.