高效液相色谱法测定支扩养阴颗粒中蒙花苷的含量

吴文飞，张利斌，李玉平(同济大学附属上海市肺科医院药剂科，上海200433)

支扩养阴颗粒系本院传统中药制剂，批准文号为沪药制字Z04180751，由羊乳根、小蓟、桑白皮、侧柏叶、麦冬等十一味药材提取配制而成，具有消炎、化痰、止血的功效，能有效治疗支气管扩张和感染所引起的咳嗽、痰多、咯血。本品在肺科医院治疗呼吸道疾病方面起着了重要作用，其生产和使用数量逐年递增。本制剂活性成分中含有黄酮，对此，经实验研究发现，可以用高效液相色谱法测定出所含抗炎抗菌成分蒙花苷。本法可作为制剂质量监控项目之一。

1 仪器与试药

1.1 仪器 美国HP 1100型高效液相色谱仪，包括手动进样器，单元泵，紫外检测器;N2000色谱工作站(浙江大学);色谱柱为 DIKMA Platisil ODS柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);BS 210S电子天平(德国赛多利斯)。

1.2 试药 蒙花苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号111528-200606);羊乳根、小蓟等药材(安徽德昌药业饮片有限公司);支扩养阴颗粒(委托上海练塘药业有限公司配制)，甲醇为色谱纯;其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性 色谱柱:DIKMA platisil ODS柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);定量环:20 μl;流动相:甲醇-水-冰醋酸(55∶44∶2);流速:1.0 ml/min;检测波长:326 nm;柱温:室温。理论板数按蒙花苷峰计算应不低于1 500［1］。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取蒙花苷对照品10.0 mg，置100 ml量瓶中，用甲醇溶解，并稀释定容，按含量以98.3%计，得98.3 μg/ml的蒙花苷对照品贮备液，密封，2～8℃冰箱贮存。

2.2.2 供试品溶液 精密称取支扩养阴颗粒10 g，置索氏提取器中，用石油醚(60～90℃)100 ml回流2 h，弃去醚液，残留物置40℃恒温箱中过夜以挥干，再置索氏提取器中用甲醇100 ml回流提取4 h，放冷，提取液过滤，置100 ml量瓶中，用少量甲醇荡洗烧瓶壁数次，洗液滤至上述量瓶中，定容，即得供试品原液。

2.2.3 阴性对照液 按处方制备不含小蓟药材的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备阴性对照液原液。

2.3 方法专属性试验 精密量取供试品原液、阴性对照原液各3 ml，对照品贮备液2 ml，分别置10 ml量瓶中，加甲醇稀释定容，旋匀，临用时，用0.45 μm孔径针头滤器过滤，按“2.1”项下的色谱条件进样测定，结果见图1。

图1 高效液相色谱图A-对照品;B-供试品;C-阴性对照品;1-蒙花苷

2.4 线性关系考察 精密量取对照品贮备液0.30、0.60、1.00、1.50、2.00、3.00、5.00和10.0 ml，分别置10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，旋匀，按“2.1”项下色谱条件，测定峰面积，以蒙花苷溶液的浓度C(μg/ml)为横坐标，峰面积值A为纵坐标，进行线性回归，得回归方程A=4.331×104C－2.949 ×103(n=5，r=0.999 9)。结果表明，蒙花苷在2.95～98.3 μg/ml范围内线性关系良好，且理论板数符合规定。

2.5 精密度试验 取蒙花苷对照品溶液(29.5 μg/ ml)，按“2.1”项下色谱条件测定6次，结果峰面积的RSD为0.67%，说明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 称取同一批号的支扩养阴颗粒6份，按“2.2.2”项下的方法制备供试品原液，分别精密量取3.0 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇稀释定容，用0.45 μm孔径针头滤器过滤，按“2.1”项下的条件进样测定，代入“2.4”项下的回归方程计算样品含量，结果测得样品平均含量为0.195 μg/mg，RSD为1.10%。可见方法的重复性良好。

2.7 稳定性试验 取同一份供试品溶液，在凉处放置，与0、4、24、48、96 h依法测定，结果测得峰面积的RSD为1.01%。表明供试液在4日内稳定。

2.8 加样回收率试验 精密量取已知蒙花苷含量为0.195 μg/mg，制剂批号为20101201的支扩养阴颗粒供试品溶液(100.855 mg/ml)2.00 ml 15份，置于10 ml量瓶中，分成3组，每组重复5份，分别精密加入39.3 μg/ml蒙花苷对照液0.60、1.00、1.36 ml，加甲醇稀释定容，旋匀，按“2.1”项下的色谱条件测定，计算回收率，结果见表1。

表1 支扩养阴颗粒加样回收率试验结果(n=15)

2.9 样品含量测定 取不同批号的供试品5批，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，作适当稀释，过滤后进样，按“2.1”项下的色谱条件测定，按外标峰面积法和“2.4”项下的回归方程计算蒙花苷的含量，结果见表2。

表2 支扩养阴颗粒含量测定结果(n=5)

3 讨论

3.1 检测成分考察 支扩养阴颗粒含小蓟、麦冬和侧柏叶等药材，这些成分中有丰富的黄酮类属物成分，笔者曾经检测出二氢黄酮类［1］;有报道可检测小蓟中芦丁［4］，含小蓟的制剂文献报道也以芦丁为测定指标［3］，而在笔者的实验研究中，用紫外光谱法和HPLC法均未测出。不同批次支扩养阴颗粒中蒙花苷含量比较接近，说明小蓟中富含的黄酮是蒙花苷，且含量比较稳定，可以将蒙花苷作为本制剂质量控制定量指标之一。中国药典一部2010年版与2005版比较，在薄层色谱鉴别中将芦丁［4］修订为蒙花苷［4］，含量测定项增订高效液相色谱法测定蒙花苷［4］，笔者研究验证了这次增修订是正确、可行的。

3.2 提取溶剂与提取方法选择 曾经采用石油醚(60～90℃)脱脂或不脱脂，以甲醇或65%乙醇为提取溶剂，索氏提取器回流或超声提取，分别考察所制取的供试品溶液的色谱结果，实验表明经石油醚回流脱脂，甲醇回流提取，所得供试品溶液与流动相有良好的互溶性，色谱杂峰少，且提取最完全。

3.3 流动相选择 考察了甲醇-水-冰醋酸(55∶45∶0.3)，(45∶54.5∶0.5)［4］，(52∶46∶2)［4］和(55∶44∶2)等数组溶剂系统，结果前3组蒙花苷色谱峰峰形欠佳，测定中有理论板数较低，经多次试验，以甲醇-水-冰醋酸(55∶44∶2)为流动相，不仅峰保留时间适宜、分离度好，而且理论板数最高，峰形相对最好。

3.3 检测波长选择 比较了蒙花苷HPLC检测波长326 nm［4］和334 nm［4，5］处测得的峰面积，结果以326 nm为检测波长峰面积大，故选择测定波长为326 nm。

［1］ 吴文飞，李玉平.紫外分光光度法测定支扩养阴颗粒中二氢黄酮的含量［J］.中国药房，2011，22(43):4083.

［2］ 崔敬浩，杨星昊，丁安伟，等.小蓟、小蓟炭中黄酮类成分的含量测定和薄层鉴别［J］.四川中医，2006，24(3):32.

［3］ 祝德秋，罗启剑，崔 岚，等.连钱草-小蓟混合粉中总黄酮的含量测定［J］.华西药学杂志，2003，18(6):477.

［4］ 中国药典2005版.一部［S］.2005:32，45，308，295.

［5］ 柯 睿，朱恩圆，侴桂新.小蓟的质量标准研究［J］.时珍国医国药，2010，21(7):1662.