幽门螺杆菌根除失败后阿莫西林耐药基因分析

朱振华，吕农华，黄德强，谢 勇，王崇文，刘林林

(南昌大学第一附属医院，南昌330006)

幽门螺杆菌(Hp)在人群中感染率很高，在慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌和胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤等消化系统疾病的发生、发展过程中起重要作用［1～3］;此外，该菌还与某些肝胆、心脑血管及皮肤病等有关。消化学界认为根除Hp是防治这些疾病的重要措施。我国属于发展中国家，在全球范围内属于感染率较高的地区，因此Hp根除治疗显得尤为重要。阿莫西林是根除Hp感染治疗中重要的抗生素，其耐药是Hp根除失败的主要原因之一。我们于2006年5月～2007年1月进行本研究，探讨Hp根除治疗失败后阿莫西林的耐药机制。

1 材料与方法

1.1 菌株 Hp菌株来自于南昌大学第一附属医院消化科内镜室，其中阿莫西林敏感菌株5株，原始耐药菌株6株，根除治疗失败后的耐药菌株4株。

1.2 药敏实验 采用纸片扩散法(K-B法)，根据药敏实验中抑菌圈的大小来判定临床菌株是否耐药。结果判断:用卡尺量取抑菌圈直径。Hp耐药标准［4］:抑菌圈直径＜30 mm。质量控制:药敏实验加入标准敏感菌株Hp11637，作为敏感对照菌株。

1.3 耐药基因的PCR扩增 采用北京天为时代科技有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)制备Hp基因组DNA。PCR扩增采用高保真PCR扩增试剂盒扩增Hp PBP1A的1 048 bp片段，PCR扩增分两轮进行:第一轮PCR反应体系由5 μL 2×pfu PCR mastermix、2.5 μL ddH2O、1 μL上游引物、1 μL下游引物及0.5 μL DNA模板组成，总体积为10 μL。上游引物:5'-GCGTCTAATGAAGATGAAGA-3'，下游引物:5'-TTAAAGTCCCTATAGCCATG-3'。PCR扩增反应条件:94℃4 min预变性;94℃1 min变性，61.5℃40 s退火，72℃1.5 min延伸，共30个循环;72℃7 min延伸。PCR反应产物于－20℃保存备用。第二轮PCR反应体系由20 μL 2×pfu PCR mastermix、10 μL ddH2O、4 μL上游引物、4 μL下游引物及2 μL DNA模板组成，总体积为40 μL。上游引物:5'-GCGTCTAATGAAGATGAAGA-3'，下游引物:5'-TTAAAGTCCCTATAGCCATG-3'。PCR扩增反应条件:94℃4 min预变性;94℃ 1 min变性，61.5℃ 40 s退火，72℃1.5 min延伸，共35个循环;72℃7 min延伸。PCR反应产物经2%琼脂糖凝胶电泳观察。采用北京天为时代科技有限公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(离心柱型)回收纯化PCR产物。

1.4 DNA测序及对比分析 将所有回收纯化的PCR产物送上海捷瑞生物工程有限公司进行DNA测序。采用DNA Star软件包对测序结果阅读、整理，对比分析原始耐药、敏感菌株、根除失败后耐药菌株及标准菌株的耐药基因差异。

1.5 统计学方法 采用统计软件SPSS13.0分析，描述同源性符合率采用±s，比较各组间同源性的差异时采用方差分析或t检验。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 药敏实验 345例菌株中，阿莫西林原始敏感菌株322例，原始耐药菌株23例，原始耐药率达6.7%。另20例根除治疗失败的Hp菌株中，阿莫西林耐药菌株5例，敏感菌株15例。

2.2 耐药基因PBP1A的PCR产物 原始耐药菌株6株，敏感菌株5株，根除失败后耐药菌株4株，其PCR产物均出现1 048 bp(26695 Hp0597 PBP1A的一部分)的条带，未见异常条带。图1为根除失败的4株耐药菌株电泳图。

图1 PBP1A基因PCR产物电泳结果

2.3 23S rRNA的突变分析

2.3.1 临床菌株与标准菌株Hp26695同源性比较

成功完成DNA测序者原始阿莫西林耐药菌株6株、敏感菌株5株和根除失败后耐药菌株4株。采用DNA Star软件包中MegAlign软件将临床菌株的PBP1A序列与Hp26695的PBP1A序列进行同源性比较，同源性分别为90.26%±3.45%、95.52%± 2.73%、95.48%±0.89%，P＞0.05，临床菌株与标准菌株的同源性结果基本相似。

2.3.2 临床菌株的框移突变情况 对临床菌株的PBP1A基因框移突变进行比较，采用DNA Star软件包中 MegAlign软件将临床菌株与标准菌株Hp26695 PBP1A对比进行DNA分析，结果表明:临床耐药菌株的框移突变比敏感菌株发生率高，阿莫西林敏感菌株框移突变0例，原始耐药菌株2例，根除失败后耐药菌株1例。其中2株原始耐药菌株与1株根除失败的耐药菌株发生框移突变导致突变以后的蛋白质氨基酸的翻译发生严重改变，其他耐药菌株突变主要为碱基的替代，只引起单个氨基酸改变，不导致整条肽链的改变;而在敏感菌株未见任何框移突变。由于例数过少，故未做统计学分析。

2.3.3 临床菌株与标准菌株氨基酸序列同源性比较 采用DNA Star软件包中的MegAlign软件，将临床菌株与Hp26695氨基酸序列进行同源性比较，结果表明:原始耐药菌株和根除失败后耐药菌株的PBP1A氨基酸序列同源性比敏感菌株低。方差分析示，原始敏感菌株(93.28%±6.21%)与原始耐药菌株(40.52%±18.48%)及根除失败后耐药菌株(80.05%±32.01%)两两比较，差异有统计学意义，P＜0.05。

3 讨论

β-内酰胺类抗生素在体外有很高的抗Hp活性，阿莫西林是临床上惟一用于治疗Hp感染的β-内酰胺类抗生素，它在酸性环境下高度稳定，可专一地与细菌内膜上靶位点结合干扰细菌细胞壁黏肽合成，使细菌胞壁缺损，菌体膨胀裂解而致细菌死亡。那些能与青霉素G共价结合的细菌内膜靶位点被称之为青霉素结合蛋白(PBPs)，它是一系列合成细菌细胞壁肽聚糖层的酶。最初研究［5］显示，有3种高分子量 PBPs存在，被命名为 PBP1、PBP2和PBP3。后来又发现一种低分子量PBPs，被命名为PBP4［6］。PBP1A基因作为PBP1蛋白的编码基因之一，与 Hp阿莫西林耐药性密切相关。Gerrits等［7］用阿莫西林耐药菌株的PBP1A基因替代敏感菌株1061的PBP1A基因，使敏感菌株1061的最低抑菌浓度增加了100倍，序列分析发现PBP1蛋白中存在丝氨酸414→精氨酸置换，因此他们认为在PBP1蛋白中的氨基酸置换会导致阿莫西林最低抑菌浓度的升高。有文献报道，阿莫西林耐药还与β-内酰胺酶有关，但Dore等［8］研究发现所有对阿莫西林耐药的菌株β-内酰胺酶均阴性;且大量临床研究也证实β-内酰胺酶抑制剂并不能使含阿莫西林的根除方案根除率提高。由此可以看出β-内酰胺酶仍难以解释阿莫西林耐药，而PBP1A基因突变才可能是阿莫西林耐药性产生的主要原因。

本课题通过对原始敏感菌株、耐药菌株和根除失败后耐药菌株的研究，发现原始耐药菌株及根除失败后耐药菌株PBP1A基因核苷酸的同源性与敏感菌株统计学上无显著差异;根除失败后耐药菌株突变频率稍低于原始耐药菌株，这可能与原始耐药菌株受长期外界刺激、抽样误差及样本含量过少有关。通过氨基酸序列对比发现，原始耐药菌株和根除失败后的耐药菌株PBP1氨基酸序列同源性均低于敏感菌株，提示氨基酸的置换可能会导致耐药性的产生。尤其是其中3株耐药菌株因碱基的缺失或插入导致框移突变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变，其后果是翻译出的蛋白质完全不同而最终导致阿莫西林无法与Hp结合，耐药性便随之产生。而在我们所研究的敏感菌株中未发现一株出现框移突变。因此，我们认为PBP1蛋白的氨基酸置换可能与阿莫西林耐药有密切关系。理论上讲，有框移突变的临床菌株耐药程度应该显著高于其他形式突变所致的耐药菌株，但由于我们的药敏实验方法适用于确定耐药性，在确定耐药程度上还有一定缺陷，而E-test法相对比较准确。下一步可考虑对这几株出现框移突变的菌株进行E-test药敏法确定其耐药程度，以明确框移突变在引起耐药性及耐药程度方面所起的作用。虽然E-test药敏法较为精确且方便，但其昂贵的价格并不适于我们进行大规模的药敏实验，因此我们药敏实验在初筛时还是首选纸片扩散法。

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