有毒中药甘遂醋炙工艺研究

石典花， 张姗姗， 孙立立*

(1.山东省中医药研究院，山东济南250014;2.山东中医药大学，山东济南250014)

甘遂为大戟科植物甘遂Euphorbia kansui T.N.Lion ex T.P.Wang.的干燥块根［1］，别名主田、猫儿眼、苦泽、陵泽、甘藁、陵藁、九头狮子草等［2］。主要产于陕西、山西、河南、山东、宁夏等地，以陕西产者质量最佳。甘遂属有毒中药，始载于《神农本草经》，列为下品。2010年版中国药典一部载甘遂具有泻水逐饮，消肿散结的功效。用于水肿胀满，胸腹积水，痰饮积聚，气逆咳喘，二便不利，风痰癫痫，痈肿疮毒等［1］。现代研究表明，甘遂化学成分具有抗肿瘤、抗生育、抗病毒、调节免疫系统等活性［3］。临床常用于治疗晚期食道癌、乳腺癌等恶性肿瘤以及慢性支气管炎哮喘等症［4］。

目前甘遂的炮制多以醋炙为主，但全国炮制工艺很不统一［5-10］，更无具体的量化参数，只是单纯依靠老药工炮制经验，或单纯依靠化学成分为指标优选工艺参数［11-12］，导致醋甘遂的质量参差不齐，进而影响了临床疗效。本研究在传统制法的基础上，采用L9(34)正交试验法，优选最佳醋炙工艺，为醋甘遂的炮制和饮片的质量控制提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters 2695高效液相色谱仪，Waters 2996 DAD检测器;瑞士METTLER XS205 DU10-5电子天平 (梅特勒-托利多仪器上海有限公司);红外温度仪ST80(北京雷泰光电技术有限公司);数显电子恒温水浴锅 (金坛市晶玻实验仪器厂);电炒药机 (哈尔滨市测电器厂);MILLI—Q超纯水纯化系统;RE—2000旋转蒸发仪 (上海亚荣生化仪器厂);索氏提取器等。

1.2 试药 乙腈为色谱纯;乙酸乙酯、石油醚等均为分析纯;龙门米醋 (北京王致和味滋康食品有限公司，生产日期201001272);甘遂药材由安徽亳州沪谯中药饮片厂提供，产地为陕西。

2 方法与结果

2.1 醋炙工艺的正交设计 在前期研究工作基础上，确定了甘遂醋炙的主要影响因素为加醋量、炒制时间、炒制温度，采用L9(34)正交设计法，以外观质量和内在质量作为评价指标，采用加权法进行评分，对试验结果进行分析。

2.1.1 外观质量评分依据和标准 中药饮片的外观性状评价是中医药宝贵经验的总结，能较直观的反映出饮片的质量好坏，因此将其作为正交试验的评价指标之一。依据炮制专家的传统经验制定醋甘遂的评分标准:根据样品的表面颜色、断面颜色、着色是否均匀、焦斑数量及有无醋焦香气等对醋甘遂进行传统质量评分，质量最好的为100分。

2.1.2 内在质量评价指标及标准 甘遂是有毒中药，经醋炙后可降低其毒性，缓和其峻泻之性，经前期急性毒性试验和药效实验研究表明，甘遂醋炙前后的毒效部位均是石油醚部位，因此采用HPLC梯度洗脱法对此部位进行测定，选择其中15个特征峰峰面积之和作为优选甘遂最佳醋炙工艺的指标之一。

2.1.3 正交试验因素、水平设计 见表1。

表1 甘遂醋炙因素、水平Tab.1 Fatorsand levelsofstir-fried KansuiRadix with vinegar

2.2 毒效部位HPLC特征图谱研究

2.2.1 色谱条件 Diamonsil-C8(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱;柱温30℃;流动相为乙腈-0.2%磷酸 (梯度洗脱，见表2);体积流量1 mL/min;检测波长203 nm。

2.2.2 供试品溶液的制备 取醋甘遂粉末 (过四号筛)约10 g，精密称定，置索氏提取器中，精密加入石油醚90 mL，加热回流提取8 h，提取液减压回收，残渣用体积比为1∶1的石油醚和乙酸乙酯混合溶剂溶解，并转移至10 mL量瓶中，加混合溶剂至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

表2 梯度洗脱条件Tab.2 Conditions of gradient elution

2.2.3 方法学考察

精密度试验 取醋甘遂 (正交4号样品)供试品溶液10 μL，连续进样6次，分别对其中15个特征色谱峰保留时间和峰面积进行统计。结果，15个特征峰的保留时间和峰面积基本一致，RSD均小于3%，表明精密度良好。

稳定性试验 取醋甘遂 (正交4号样品)供试品溶液10 μL，分别于0、2、4、8、12、24 h测定，分别对其中15个特征色谱峰保留时间和峰面积进行统计。结果，15个特征峰的保留时间和峰面积基本一致，RSD均小于3%，表明24h内测定结果稳定。

重复性试验 取醋甘遂 (正交4号样品)粉末6份 (过四号筛)，照供试品溶液的方法制备，依次测定，分别对其中15个特征峰保留时间和峰面积进行统计。结果，15个特征峰的保留时间和峰面积的RSD均小于3%，表明重复性良好。

2.2.4 测定法 分别精密吸取供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。测定图谱及特征峰标识见图1。

图1 醋甘遂毒效部位HPLC特征图谱Fig.1 HPLC characteristic chromatography of the toxic and effective part in stir-fried Kansui Radix with vinegar

2.3 试验方法与结果

2.3.1 正交试验样品的制备 取大小均一的净甘遂各100 g，共取9份，按正交试验设计方案进行实验，加入不同比例的醋拌匀，闷润，待醋吸干，置预热至一定温度的电炒药锅中，不断翻炒，以红外线测温仪测量控制锅底温度，炒制相应时间，取出，放凉，再精密称取各醋炙品质量，计算各炮制品得率。以上述确定的测定方法和评分标准，对不同条件下制备的醋甘遂进行传统质量评分，对内在质量进行测定。

2.3.2 外观质量评分 正交1～9号醋甘遂，一次性送给一位炮制专家进行评定，9份样品逐个打分，共请了3位专家评审，每个样品的平均值作为外观质量的得分。

2.3.3 内在质量评价指标的测定 照2.2项方法进行测定，结果见表3。

表3 样品得率及特征峰面积之和测定结果Tab.3 Yield of samples and the sum of the characteristic peaks area

2.3.4 内在质量得分 根据与生品换算后各供试品特征峰峰面积之和与甘遂生品特征峰峰面积之和的比值 (结果见表3)并综合考虑毒性和药效的关系，认为，比例段在0.80～0.95者为佳，其中规定比例为0.9为100分，0.80～0.95比例段每增加或减少0.01减2分，其他比例段每增加0.01减1分，具体见表4。

表4 得分表Tab.4 The table of score

2.3.5 综合质量评分 外观质量和甘遂毒效部位对醋甘遂有着同等重要的意义，因此两者的加权系数均为0.5，综合评分以下式计算:

综合质量评分=外观质量得分×0.5+毒效部位特征峰面积得分×0.5

各种条件下醋甘遂综合评分结果见表5。方差分析见表6。

表5 L9(34)正交试验结果及直观分析表Tab.5 Results of L9(34)orthogonal test and visual analysis

表6 方差分析Tab.6 Variance analysis

2.3.6 试验结果分析

直观分析由表5的极差 (R)可以看出，在该正交试验设定的因素、水平条件下，对综合评分影响大小的因素进行分析，依次为B＞C＞A，即B因素影响最大，其次为C因素，A因素影响最小;对A因素有k2＞k3＞k1，对B因素有k1＞k3＞k2，对C因素有k2＞k3＞k1。因此，对综合质量评分而言，最佳炮制工艺条件为A2B1C2。

方差分析 由表6可以看出，以A因素项为误差，B因素的P＜0.01，表明B因素对醋甘遂质量有极显著性影响。

2.3.7 甘遂最佳醋炙工艺的确定 由上述试验结果可以得到，甘遂最佳醋炙工艺条件应为A2B1C2，即:取净甘遂适量，加入30%的醋，闷润，待醋吸干，置预热至230℃电炒药锅内，炒制30 min，取出，晾凉。

2.3.8 醋甘遂最佳炮制工艺验证试验 为考察正交试验的合理性和可重复性，用同一电炒药锅和同一批甘遂，进行了验证试验。取净甘遂3份，每份1 kg，加入0.3 kg的醋，闷润，待醋吸干，置预热至230℃电炒药锅内，炒制30 min，取出，晾凉，再精密称取各醋炙品质量，计算各炮制品得率。考察醋甘遂的外观质量，并进行醋甘遂毒效部位特征图谱测定。3批工艺验证试验的主要数据见表7。

表7 甘遂醋炙工艺验证试验结果Tab.7 Results of validation test of the technology of Kansui Radix stir-fried with vinegar

3批验证试验结果表明，醋甘遂的得率约为94%，醋炙后甘遂外观性状与传统外观性状评价保持一致，醋甘遂毒效部位特征峰面积之和基本一致，说明正交试验确定的工艺稳定，可重复性强。

3 小结与讨论

本实验依据甘遂醋炙减毒增效原理，根据前期研究确定的甘遂毒效部位的HPLC特征指纹图谱分析条件，对此部位进行测定，并以此为指标，结合醋甘遂的传统外观质量，采用综合质量评分法，对醋甘遂的炮制工艺进行优选，这种方法较单纯采用甘遂中某一成分为指标来优选甘遂醋制工艺的方法更加科学，合理，更能够客观的反映各个因素水平对醋甘遂质量的影响。

实验结果表明甘遂最佳醋炙工艺为:取净甘遂适量，加入相当于药材量30%的醋，闷润，待醋吸干，置预热至230℃电炒药锅内，炒制30 min，取出，晾凉。经3批验证实验表明该工艺稳定，可重复性强，优选出的醋甘遂最佳炮制工艺，明确了加醋量、炒制温度和炒制时间等炮制参数，可为规范醋甘遂生产，有效控制醋甘遂质量提供理论依据。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:81.

［2］权宜淑.中药甘遂的本草调查［J］.西北药学杂志，1994，12(9):255-257.

［3］郭晓庄.有毒中草药大辞典［M］.天津:天津科技翻译出版公司，1992:7.

［4］王立岩.甘遂的化学成分及其生物活性的研究［D］.沈阳:沈阳药科大学，2003.

［5］中华人民共和国卫生部药政管理局.全国中药炮制规范［S］.北京:人民卫生出版社，1988:29.

［6］山东省药品监督管理局.山东省中药炮制规范［S］.山东:山东友谊出版社，2003:44.

［7］河南省革命委员会卫生局.河南省中药材炮制规范［S］.河南:河南人民出版社，1974:50.

［8］浙江省卫生厅.浙江省中药炮制规范［S］.浙江:浙江科学技术出版社，1986:54.

［9］湖南省卫生厅.湖南省中药材炮制规范［S］.湖南:湖南科学技术出版社，1989:36.

［10］福建省卫生厅.福建省中药炮制规范［S］.福建:福建科学技术出版社，1988:117.

［11］李 媛，张 丽，单鸣秋，等.正交试验优选甘遂醋制最佳工艺［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17(7):4-6.

［12］张 丽，束晓云，唐于平，等.醋甘遂饮片炮制工艺研究［J］.中国中药杂志，2009，34(6):681-684.