冠心宁注射液中单糖、寡糖的定量测定研究

黄琴伟， 唐登峰， 李樱红， 李 正， 祝 明

(浙江省食品药品检验所，杭州浙江310004)

冠心宁注射液具有活血化瘀，通脉养心作用，用于冠心病心绞痛［1］。由于冠心宁注射液由丹参、川芎两味药组成，为中药注射液，所含成分复杂，故其成分分析对保障临床用药安全起着至关重要的作用。作者曾对丹参和川芎中的水溶性成分丹参素钠、原儿茶醛、阿魏酸、迷迭香酸和丹酚酸B等进行定量测定，所测得的量占总固体仅为2%～3%，表明冠心宁注射液中仍有大部分成分为未知成分。查阅冠心宁注射液的质量标准［1］，制法项未添加果糖、葡萄糖、蔗糖等辅料。另根据文献报道［2-4］，川芎药材中含有较多糖类成分，丹参药材中也含有少量的糖类，故对冠心宁注射液的糖类成分进行分析有助于完善其基础物质研究，完善冠心宁注射液的质量控制方法。本实验从临床用药安全角度出发进而提高和完善样品质量控制，对冠心宁注射液中糖类成分进行分析测定。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent1100型系列高效液相色谱仪:包括G1311A四元泵，G1322A脱气机，G1329A自动进样器，G1316A柱温箱，Alltech 2000蒸发光散射检测器。

1.2 试药 果糖对照品 (批号:100231-200303)、D-无水葡萄糖对照品 (批号:110833-200904)、蔗糖对照品 (批号:1507-200001)均由中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用。乙腈为色谱纯，水为重蒸水。共收集了6个厂家共71批样品，样品信息见表1。

吸取上述对照品贮备液3.0 mL，置10 mL量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀即得，作为线性溶液①。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 以糖基为填充剂 (Prevail Carbohydrate ES柱4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相为乙腈-水 (79∶21);体积流量1.0 mL/min;ELSD检测器;漂移管温度100℃;N2流量2.8 L/min。

2.2 对照品溶液的制备 分别称取果糖对照品、葡萄糖对照品、蔗糖对照品377.50 mg、282.05 mg及408.21 mg，置25 mL量瓶中，加水使溶解并稀释至刻度，摇匀即得，作为对照品贮备液。

表1 71批冠心宁注射液信息Tab.1 Information of 71 batches of Guanxinning Injection

吸取上述线性溶液①2.0 mL，置5 mL量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀即得，作为线性溶液②。

另分别称取果糖对照品、葡萄糖对照品、蔗糖对照品249.10 mg、175.75 mg及255.56 mg，置15 mL量瓶中，加蒸馏水使溶解并定容至刻度，摇匀即得，作为对照品溶液③。

吸取对照品溶液③3.0 mL，置10 mL量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，作为对照品溶液④。

2.3 供试品溶液的制备 取冠心宁注射液2.0 mL置10 mL量瓶，加水至刻度，摇匀，作为供试品溶液。色谱图见图1。

图1 冠心宁注射液单糖、寡糖测定对照品(A)和样品 (B)HPLC图Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances(A)and Guanxinning Injection(B)

2.4 线性关系考察 精密吸取一定体积的上述各对照品溶液 (线性溶液①1、2、5、10、15、20、25、30 μL;线性溶液②1、2 μL)分别注入色谱仪，以进样量 (μg)的对数值 (lgW)为横坐标(X)，以峰面积的对数值 (lgA)为纵坐标 (Y)进行线性回归，建立3种标准糖的线性回归方程，分别为:果糖 Y=1.707 1 X+8.707 8，r=0.999 6;葡萄糖 Y=1.762 9 X+7.323 2，r=0.999 7;蔗糖 Y=1.672 3 X+8.253 9，r=0.998 7。结果表明:果糖、葡萄糖、蔗糖分别在1.812 ～45.300 μg、1.354 ～ 101.538 μg、1.959 ～146.956 μg范围内呈良好的对数线性关系。

2.5 精密度考察 取同一份供试品溶液 (批号:091108)，重复进样6次，记录峰面积，果糖、葡萄糖、蔗糖的RSD分别为0.2%、0.3%、0.2%，结果表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取同一份供试品溶液 (批号:091108)，分别在 0、4、8、12、16、21、26 h时注入色谱仪，记录果糖、葡萄糖、蔗糖峰面积，考察样品的稳定性，试验结果果糖、葡萄糖、蔗糖的RSD分别为0.1%、0.2%、0.2%，表明被测溶液在26 h内稳定。

2.7 重复性试验 按供试品溶液制备方法，取同一批样品 (批号091108)共6份，注入液相色谱仪，依法测定。结果表明，冠心宁注射液中果糖、葡萄糖、蔗糖及总糖质量浓度分别为32.584、24.225、35.140 mg/mL及91.949 mg/mL，其RSD分别为0.21%、0.37%、0.18%及0.23%。

2.8 准确度试验 取同一批样品 (批号091108)各1.0 mL，共9份，每3份为一个水平，分别精密加入对照品溶液③1.0、2.0、3.0 mL，按2.3项下制备供试品溶液并按上述色谱条件进行分析，计算回收率和RSD。结果表明，果糖、葡萄糖、蔗糖及总糖的平均回收率分别为105.9%、105.8%、105.3%及105.6%，RSD分别为3.5%、4.2%、3.5%及3.6%，回收率符合要求，结果见表2。

2.9 样品测定 按供试品溶液制备方法，取71批供试品溶液各5 μL，注入液相色谱仪，依法测定，结果见表3。

3 讨论

3.1 糖类物质是含多羟基的醛类或酮类化合物。糖类化合物包括单糖、单糖的聚合物及衍生物。以它们水解的情况分类，凡不能被水解成更小分子的糖为单糖，能水解成少数 (2～10个)单糖分子的为寡糖 (或低聚糖)。由于冠心宁注射液的制备工艺中有二次醇沉过程，药材中的多糖类成分均被醇沉，故仅对药材中的单糖寡糖进行分析。

3.2 查阅文献，目前各种单糖和寡糖的分析方法有薄层色谱法 (TLC)［5-7］、薄层色谱扫描法(TLCS)［7］、气相色谱法［8-9］、高效毛细管电泳法(HPCE)［10］、聚丙烯酰胺凝胶电泳法 (PAGE)［11］、和高效液相色谱法 (HPLC)［12-13］。本实验拟采用高效液相色谱法，由于糖类没有紫外吸收，故用高效液相色谱法测定糖类化合物多采用HPLC-RID、HPLC-ELSD和衍生化，为使方法简单、可行，本实验采用ELSD-HPLC法对糖类成分进行分析。

3.3 收集多个单糖、寡糖对照品，采用对照品对照法，通过保留时间比较，确证了色谱图中3个主要色谱峰，分别为果糖、葡萄糖、蔗糖。

3.4 通过对6个不同企业抽验的71批样品进行果糖、葡萄糖、蔗糖3种糖的测定，分析3种糖质量浓度可知，6个厂家的冠心宁注射液中均含有果糖、葡萄糖和蔗糖，但从数据可见F厂家的冠心宁注射液中蔗糖的质量浓度极低，为1.943～5.306 mg/mL，B厂家的冠心宁注射液中的葡萄糖质量浓度相对较低，为6.209～18.897 mg/mL。

表2 冠心宁注射液中单糖、寡糖准确度试验结果 (n=9)Tab.2 Results of recovery tests of Guanxinning Injection(n=9)

3.5 结合总固体物测定结果进行分析，3种糖总量占总固体比例为38.0%～90.9%，A厂家糖总量占总固体比例为42.0%～74.9%、B厂家糖总量占总固体比例为43.9%～58.8%、C厂家糖总量占总固体比例为38.0%～54.3%、D厂家糖总量占总固体比例为38.0%～90.9%、E厂家糖总量占总固体比例为48.5%～53.5%、F厂家糖总量占总固体比例为50.0%～77.0%。其中A厂家糖总量占总固体比例相对偏高，糖总量占总固体60%以上的占72.7%，C厂家和E厂家糖总量占总固体比例相对偏低。

表3 冠心宁注射液中单糖、寡糖测定结果 (n=2)Tab.3 Result of content determination of samples(n=2)

续表3

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