大孔树脂分离纯化青钱柳总黄酮的工艺研究

郦红岩，陈 建，赵 雷

江苏吉贝尔药业有限公司，镇江 212009

青钱柳[Cyclocarya paliurus（Batal.）Iljin.]广泛分布于江西、浙江、江苏、安徽、福建等地，是我国特有的速生树种。动物实验和临床研究表明，青钱柳有降血压、降血糖、降血脂、增强免疫力的功效，是一种值得开发的天然资源[1]。青钱柳中具有丰富的黄酮类化合物，如槲皮素、山奈酚、山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖、山奈酚-4′-甲醚-7-O-β-D-甘露糖[2]、儿茶素、南酸枣乔松素-7-O-吡喃葡萄糖苷[3]等。研究表明，青钱柳黄酮是α-葡萄糖苷酶抑制剂，有很强的抑制活性，能显著降低糖尿病小鼠空腹血糖[4]。

目前有大量的文献报道证实，大孔树脂对于黄酮类物质的纯化精制具有良好的效果，已被成功用于多种中草药中黄酮类物质的分离纯化[5]。本研究采用水提、大孔树脂吸附、解吸来纯化青钱柳中总黄酮，为青钱柳的深度开发提供参考。

1 仪器、原料与试药

岛津UV-2550紫外分光光度仪；CP225D电子天平（德国赛多利斯）。

芦丁对照品（中国药品生物制品检定所，批号：100080-200707）；HPD722、HPD100、D101、HPD400、HPD600、HPD427大孔树脂 （购自沧州宝恩吸附树脂材料科技有限公司）。试剂为分析醇；水为蒸馏水。

青钱柳购自福建龙岩地区，经江苏大学欧阳臻教授鉴定确认为青钱柳（样品标本存放于本公司）。

2 总黄酮测定

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取在120℃干燥至恒重的芦丁对照品0.2 g，精密称定，置100 mL量瓶中，加95%乙醇70 mL，超声使溶解，加乙醇至刻度，摇匀，精密量取10 mL，置100 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得（每1 mL中含无水芦丁0.2 g）。

2.1.2 供试品溶液的制备 精密量取洗脱液25 mL，置50 mL量瓶中，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，混匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加氢氧化钠试液10 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，过滤，在500 nm波长处测定吸光度。

2.2 标准曲线制备

精密量取芦丁对照品溶液 （0.2 mg·mL-1）1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分别置25 mL量瓶中，加水至6 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，混匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加氢氧化钠试液10 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min。以相应的溶液为空白。照紫外-可见分光光度法，在500 nm波长处测定吸光度。以浓度C为横坐标，吸光度B为纵坐标，绘制标准曲线，得标准曲线方程Y=0.0130X-0.01791（r=0.9996）。芦丁在8.224～49.344 μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.3 上样液的制备

取青钱柳约120 g，粉碎，分别用15、10、10倍量的水提取3次，每次1.5 h，过滤，合并提取液，减压浓缩至适当浓度，加乙醇使含醇量为50%，静置12 h以上，过滤，滤液减压浓缩，备用。

2.4 大孔树脂预处理

以95%乙醇浸泡过夜，用纯化水洗至无醇味，再用4%的HCl溶液冲洗，水洗至中性；再用4%的NaOH溶液冲洗，水洗至中性。

2.5 大孔树脂筛选

将已处理好的6种大孔树脂各15 g湿法装柱，加入上样液（相当于10 g药材量），用水洗至流出液近无色，再用固定量的60%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，测定洗脱液中总黄酮的含量。

表1结果表明，D101大孔树脂对于青钱柳总黄酮的吸附纯化效果较好，因此选用D101大孔树脂分离纯化青钱柳总黄酮。

表1 6种树脂筛选比较吸附效果

2.6 大孔树脂的饱和吸附

取处理好的树脂200mL备用，取青钱柳上样药液以10、20、30、40、50、60、70、80 g（按药材量计）上样，每次上完样后用水续洗至无色，再用60%乙醇400 mL洗脱，测定乙醇洗脱液的吸光度。试验结果表明，上样量大于60 g时，乙醇洗脱液的吸光度基本不再变化，故以60 g作为饱和吸附量。

2.7 乙醇洗脱正交试验及结果

青钱柳提取液用D101大孔树脂吸附后，用纯化水冲洗至流出液近无色，再用适当浓度的乙醇洗脱，搜集洗脱液，以总黄酮含量为考察指标，以上样量A（1.5、2.0、2.5）、上样流速B（10、20、30 BV·min-1，BV为倍树脂体积，下同）、醇洗浓度C（50%、60%、70%）三个因素作为考察因素，选用L9（34）正交表进行试验。

从试验结果可知，以总提取物为指标，最佳的提取工艺为A1B3C3，即用1.5 BV的上样量，30 BV· min-1的上样流速，70%乙醇洗脱效果最佳；而以总黄酮为指标，最佳的提取工艺为A1B3C1，即用1.5 BV的上样量，30 BV·min-1的上样流速，50%乙醇洗脱效果最佳。由于青钱柳中黄酮为有效活性成分，所以选用总黄酮作为主要考察指标，分析结果表明，A（上样量）对结果影响较大，B（上样流速）和C（醇洗浓度）相对较小，且综合上样的效率来看理想的组合为A1B3C1，确定1.5BV的上样量，30 BV·min-1的上样流速，50%乙醇洗脱作为最佳工艺。

2.8 正交试验验证

按正交试验选取的最佳分离纯化工艺条件A1B3C1进行重复试验，3次青钱柳总黄酮的平均含量为75.1%（见表2），表明该工艺稳定可行。

表2 验证A1B3C1工艺

3 讨 论

大孔吸附树脂是一类不含交换基团且有大孔结构的高分子吸附树脂，具有良好的大孔网状结构和较大的比表面积，可以通过物理吸附从水溶液中有选择地吸附有机物，是一种不溶于酸、碱及各种有机溶剂的有机高分子聚合物，其孔径与比表面积都比较大，在树脂内部具有三维空间立体孔结构，具有物理化学稳定性高、比表面积大、吸附容量大、选择性好、吸附速度快、解吸条件温和、再生处理方便、使用周期长、宜于构成闭路循环、节省费用等诸多优点。目前已广泛用于中草药中各种成分的分离纯化。本实验通过比较，发现D101型大孔树脂对青钱柳黄酮有较大的吸附量，且容易吸附和解吸，用于分离纯化青钱柳总黄酮效果较好。与传统的分离方法相比较，应用大孔树脂分离纯化青钱柳总黄酮，方法简便、迅速、经济。

[1] 谢明勇，李 磊.青钱柳化学成分和生物活性研究概况[J].中草药，2001，32（4）：365-6.

[2] 李 俊，陆园园，许子竞，等.青钱柳中黄酮成分的研究[J].中药材，2005，28（12）:1058-9.

[3] 张晓瑢，廖 循，丁立生.青钱柳的化学成分[J].应用与环境生物学报，2001，7（1）：90-1.

[4] 杨武英，上官新晨，徐明生，等.青钱柳黄酮对α-葡萄糖苷酶活性及小鼠血糖的影响[J].营养学报，2007，29（5）：507-9.

[5] 张全香，苑晓威，赵兴华.大孔吸附树脂纯化骨碎补总黄酮的研究[J].中草药，2011，42（4）：708-9.