HCV细胞培养系统研究进展

陈 娜，刘叶红，刘 敏

丙型肝炎（丙肝）是由HCV 引起的一种疾病，全球约有1.7 亿例丙肝患者[1]。丙肝极易慢性化，是肝脂肪变、慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌发生的主要原因之一，严重危害人类健康，但临床缺乏有效的预防和治疗手段。已知HCV 有6 种基因型（1、2、3、4、5、6 型）和超过80 种亚型[2]。我国以1b 型为主，多数学者认为l 型与肝癌的发生相关。基因l型，特别是1b 亚型，与慢性丙肝进展为严重肝病相关。另外，基因型也与治疗效果相关：在长效干扰素┼利巴韦林的标准治疗方案中，2 型和3 型的治疗效果明显优于1 型和4 型。迄今为止，HCV 感染的发病机制尚不完全清楚，有学者认为主要与HCV 的高度变异性及难以建立稳定可靠的HCV 体外感染模型相关。

1 HCV 的生物学特性

HCV 属于黄病毒科有包膜的单股正链RNA 病毒，基因组全长9.6 kb[3]，编码3010 个氨基酸残基的多聚蛋白，由5′和3′末端的非编码区（untranslated region,UTR）和中间1 个开放阅读框组成（图1）。HCV 基因组的翻译依赖于5'- UTR 的内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site,IRES），首先翻译出1 个聚合多肽，随后由宿主和病毒自身编码的蛋白酶将其剪切为不同的蛋白。其中结构蛋白包括衣壳蛋白C、包膜蛋白E1 及E2，主要与病毒的侵入和组装有关。尤其是E2 与HCV 细胞表面受体CD81 有关，P7 蛋白和非结构蛋白2（non-structure 2,NS2）参与调控病毒组装和释放，NS4A、NS4B及NS5A 主要参与病毒基因组复制，NS3 和NS5B与病毒复制及抗病毒药物有关，NS5B 编码RNA 依赖的RNA 聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase,RdRp），是HCV 基因组复制的核心酶。目前认为NS3 聚合酶/解旋酶和NS5B RdRp 的活性是抗HCV的关键[4]。

图1 HCV 的基因结构[3,5]Figure1 Genomic structure of HCV[3,5]

2 HCV 培养系统

2.1 组织培养 最初有学者发现，用感染HCV 的血清感染人胎肝细胞后，肝细胞内能检测到正链病毒，但其复制率很低[6]。病毒复制能对肝细胞产生很大的细胞毒作用，因此寻找能永生感染HCV 的靶细胞成为热点。最后发现如外周血单核细胞、T 淋巴细胞、成纤维细胞VH3 和肝细胞都适于HCV 的感染和复制。但由于其复制率低和重复性差等缺点，不是HCV 体外培养的最佳细胞模型。

2.2 基因组复制子 基因组复制子包括全长基因组复制子（包含HCV 全基因组）和亚基因组复制子（仅包含与HCV 复制有关的非结构蛋白区）。见图2。这2 种类型的复制子在非结构蛋白区（NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）前都有HCV IRES、NEOR（新霉素磷酸转移酶基因）及脑心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus,EMCV）IRES，这些基因都须要T7 启动子启动复制，复制完成后转染至Huh-7（来源于人肝癌细胞），用G418 筛选HCV 复制成功的细胞，进行克隆[7-8]。

图2 HCV 基因组复制子[9]Figure2 HCV genomic replicon[9]

用荧光素酶替代NEOR可用于瞬时转染分析适应性突变。NS5A 区的适应性突变能引起干扰素抵抗，高度适应性的5.1 复制子也包含3 个突变区（2个NS3 和1 个NS5），这些适应性突变区都是HCV 高度复制的区域[10]。与组织培养模型相比，含有复制子的靶细胞没有明显的细胞毒作用，因此亚基因组复制子模型对抗HCV 药物的研究非常重要。

随着对复制子研究的深入，有学者将荧光蛋白基因插入HCV 亚基因复制子，通过观察荧光的亮度来判断病毒表达能力的强弱。King 等[11]构建了质粒pMJ050，该质粒中嵌合1 段含有荧光素序列的HCV 样cDNA，用pMJ050 转染293B4alpha 细胞系，能持续产生荧光素酶，可用来检测功能性HCV 蛋白的存在，并能通过荧光素酶的含量测定HCV RNA复制水平。Sun 等[12]用全长HCV cDNA 感染HepG2细胞，结果在该细胞内检测到对干扰素（interferon,IFN）敏感的HCV 负链RNA、核心蛋白及NS5B，将感染后的HepG2 导入严重联合免疫缺陷小鼠后，发现小鼠血液中有对干扰素敏感的HCV RNA 正链的表达。Heller 等[13]构建了HCV（基因1b 型）核酶表达载体，转染至Huh-7 细胞后，能产生高水平的HCV 病毒颗粒，为HCV 生物特性的研究提供条件。虽然复制子模型可以模拟细胞内HCV 基因复制与表达过程，但不能产生具有感染性的病毒颗粒，所以不能用于HCV 更深一步的研究。

2.3 HCV 感染性病毒颗粒（HCV grown in cell culture,HCVcc） 2005年，Wakita 等[14]从急性肝衰竭患者体内分离出1 株2a 型全长基因组复制子JFH-1（含有非结构基因NS3～NS5B），能转染Huh-7 细胞并产生HCVcc。Lindenbach 等[15]用2a 型J6 复制子的C 区～NS2 区和JFH-1 复制子的NS3～NS5B 非结构基因共同构成重组嵌合体FL-J6/JFH（图3）。此嵌合体能转染Huh-7.5.1 细胞（将含有HCV 亚基因组复制子的Huh-7 细胞用IFN α 长期处理，清除HCV RNA，获得Huh-7.5 细胞系；随后用人IFN γ连续3 周处理含1/5A-GFP-6 HCV 复制子的Huh-7.5细胞，得到Huh-7.5.1 细胞系，其较Huh-7 和Huh-7.5更易于支持亚基因组和全长基因组复制子的复制），大大提高了HCV 的转染效率，同时培养上清中能产生1×104～1×105U/ml 感染性病毒颗粒。但是，JFH-1 是从急性肝衰竭患者体内分离的，该病并不是一种常见疾病；另外，HCV 感染颗粒是基于2a 型基因构建的，2a 型基因并不常见，这就限制了HCVcc的应用。构建过程简述如下：①扩增模板质粒，转化DH-5α，质粒提取；②模板处理：XbaI 分别单酶切上述3 种线性化质粒（SGR-JFH1、FL-J6/JFH 和FL-H77/JFH），酶切完成后，等体积酚氯仿异戊醇（25∶24∶1）抽提纯化线性化模板，焦碳酸二乙酯水溶解沉淀，分光光度计测定3 种模板浓度；③体外转录：取制备好的3 种线性化模板按说明书进行体外转录，反应期间每隔1 h 取1μl 反应产物行甲醛琼脂糖凝胶电泳，观察RNA 产物体外转录情况，转录完成后分光光度计测定RNA 浓度；④电穿孔转染Huh-7.5细胞：取10 μg RNA 转录产物行电穿孔转染，穿孔后细胞于10 cm 培养皿内正常传代培养；⑤HCVcc的收集与保存：在电穿孔转染后7～14 d，传代细胞时，收集细胞上清，12 000 r/min 离心10 min，弃沉淀，以1.5 ml 灭菌EP 管分装上清，保存于-80 ℃。上述制备好的HCVcc 用于各种实验。

图3 不同类型HCV 复制子[15]Figure3 Different types of HCV replicons[15]

2.4 HCV 假病毒感染颗粒（HCV pseudoparticles,HCVpp）

2.4.1 反转录病毒转染构建的HCVpp 系统 2003年Bartosch 和Cosset[16]成功构建HCVpp 系统。该系统是将3 个载体共转染293T 细胞（正常人胚肾细胞）后产生的假病毒感染颗粒（图4）。其特征有2点，①CMV-gag-pol MLV 包装载体：编码反转录病毒的gag 和pol 蛋白，分别编码病毒的结构蛋白和酶蛋白（包括反转录酶），对假病毒细胞膜的形成和RNA 的衣壳化起重要作用；②MLV-GFP 载体：编码绿色荧光蛋白（GFP），易于观察；③phCMV-E1E2 包膜载体:编码HCV E1 和E2 包膜蛋白，是HCVpp 系统的核心载体。

图4 HCVpp 产生[16]Figure4 Production of HCVpp[16]

转染后的293T 细胞产生1×105个/ml 假病毒颗粒，其能感染Huh-7 细胞，并且能通过流式细胞仪检测Huh-7 细胞表达的GFP 的情况定量HCV 的感染率高低。HCVpp 也能被患者血清和anti-E1/E2的单抗所中和，用以研究HCV 糖蛋白的功能，包括细胞进入和抗体中和的作用[17-18]，还能分析HCV 表面受体（CD81、清道夫受体、低密度脂蛋白及Claudin-1 等）。膜蛋白功能的保守性可用来研究突变型病毒，能模拟HCV 感染的早期阶段，也能用于抗病毒药物的研制。

实验程序：使用前述3 种载体共转染293T，得到感染性病毒颗粒；同时用不含HCV E1/E2 的载体作为对照[19]。构建过程简述如下：①培养细胞，加2 ml 无血清DMEM 培养基，二氧化碳培养箱37 ℃培养。同时用不含HCV E1/E2 的对照载体进行相同实验。②按照脂质体说明书转染，0.75 μg 包装载体CMV-gagpol┼0.75 μg MLV-GFP 质粒┼1.0 μg HCV E1/E2 表达载体，250 μl 无血清DMEM 稀释，得到混合物A；无血清DMEM┼8 μl 脂质体试剂，室温孵育5 min，得到混合物B；A┼B 混合，室温孵育20 min，得到混合物C。将C 均匀加入细胞中。③6 h 后，用DMEM┼胎牛血清（FBS）培养基替换旧培养基，37 ℃培养48～72 h，肉眼观察GFP 转染效率达80%～90%；或用流式细胞仪分析GFP 阳性的293T 的转染效率。④收集293T 上清，用0.45 μm 滤器滤过细胞碎片，感染Huh-7.5 细胞（避免反复冻融），剩余上清液-80 ℃保存。⑤12 孔板培养Huh-7 细胞，1×105个/孔。混合物D：8 μg/ml 多聚胺┼10%FBS ┼1%抗生素┼DMEM 24 h 后，换用D 培养液继续培养，每孔加200 μl 病毒上清37 ℃吸附3～4 h 后，换用1 ml 新鲜培养基。⑥培养48～72 h 后，消化细胞，用1%多聚甲醛的PBS 重悬固定。⑦流式细胞仪计数GFP 的阳性细胞比率，488 nm 激发波长观察GFP 表达情况。提纯后的HCVpp 用于各种实验。

2.4.2 3 种质粒共转染构建的HCVpp 系统 2008年张柯等[20]将携带HCV 代表株H77（1a）、中国HeBei株（1b）及JFH-1 株（2a）HCV 完整的E1/E2 包膜糖蛋白分别插入pVRC 载体，成功构建pVRC-H77-E1E2、pVRC-JFH-E1E2 和pVRC-HeBei-E1E2 这3种真核表达质粒（包膜质粒），3 种包膜质粒分别与慢病毒包装质粒pHR′CMV△8.2 及携带EGFP报告基因的转移质粒pCS-CG 共转染293T 细胞，产生3 种不同基因型的丙肝包膜感染性假型病毒颗粒，同时以PVSV-G 空载体作为阳性对照。利用p24 ELISA 法及感染性实验对HCV 假病毒进行滴定，用此3 种病毒上清和pVSV/G 假病毒体外感染HEK293、Hep G2、Huh-7 和Huh-7-CD81，经流式细胞仪分析，后者的感染效率约为前者的2～3 倍，但HCV 假病毒无法感染非肝细胞（如293T），也不能感染不表达CD81 分子的肝源性细胞HepG2。结果显示HCV 假病毒具有较严格的细胞嗜性，且其感染性为CD81 分子依赖型，与靶细胞（肝细胞）表面CD81 分子的表达水平正相关。

3 展 望

随着科研技术的进步，近年来已能对丙肝做到早发现、早诊断、早治疗，临床也已取得很大成就。如本文所讲的细胞模型、基因组复制子、HCVcc 和HCVpp 等系统的成功建立，为HCV 发病机制及治疗提供了初步研究基础。但由于上述不同细胞模型和复制子模型具有重复性差及无法产生感染性病毒颗粒等缺点，导致对HCV 感染的机制及治疗手段的研究进入停滞阶段。随后建立的HCVcc 和HCVpp系统能很好地用于对HCV 细胞培养系统的研究，该系统能产生高滴度的病毒颗粒，对研究HCV 起到很重要的作用。虽然已有研究报道可以用动物模型建立系统，但由于花费大、周期长，还须进一步寻找更适合的动物模型。同时由于难以构建包含HCV结构基因组的质粒，导致无法获得感染HCV 的体外细胞培养体系，因而对其机制研究仍处于初级阶段。由于国内在HCV 体外细胞培养系统方面技术还不够成熟，目前我们急须寻找已构建成功的HCV 包膜质粒，只有建立了稳定可靠的HCV 系统才能对其进行深入研究，进一步找到丙肝治疗及预防方法。

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