IGF-1对大鼠缺血､缺氧神经元p-JNK及p-P38表达的影响

李智勇,夏 鹰,陈晓东,罗 汉

(海南省海口市人民医院神经外科 570208)

IGF-1对大鼠缺血､缺氧神经元p-JNK及p-P38表达的影响

李智勇,夏 鹰,陈晓东,罗 汉

(海南省海口市人民医院神经外科 570208)

目的研究胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对缺血､缺氧大鼠脑皮质神经元凋亡的保护作用及作用机制｡方法 原代培养新生大鼠脑皮质神经元,建立缺血､缺氧细胞模型,观察IGF-1及IGF-1受体抑制剂(AG1024)对该模型细胞存活率(MTT试验)､细胞凋亡(流式细胞法)､JNK､P38表达(Western blot法)和Caspase-3活性(荧光测定法)的影响｡结果IGF-1(HII组)及AG1024(HIIA组)干预细胞模型24h后,模型细胞存活率分别为(77.00±3.80)%､(62.00±4.40)%;凋亡率分别达到14.58%､24.97%｡IGF-1组可明显抑制p-JNK及p-P38的表达及Caspase-3的活性｡结论IGF-1对缺血､缺氧神经元损伤有一定的保护作用,并通过调控p-JNK､p-P38及Caspase-3的表达抑制缺血､缺氧神经元的凋亡｡

胰岛素样生长因子Ⅰ;缺氧缺血,脑神经元;JNK丝裂原活化蛋白激酶类;半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶

缺 氧､缺 血 性 脑 损 伤 (hypoxia-ischemic brain damage,HIBD)是围生期新生儿脑损伤的最常见病因,重者可致永久性脑损伤,引起脑性瘫痪､智力低下等严重后遗症｡其发病机制至今不明,尚无特效治疗,近年研究表明,与HIBD有关的神经元凋亡促进了继发性脑损伤[1-2]｡因此,发病早期抗神经细胞凋亡成为HIBD救治的关键｡胰岛素样生长因子-1(insulinlike growth factor-1,IGF-1)是一种在体内､外均具有广泛生物学活性的细胞因子｡近年来,IGF-1对中枢神经系统损伤的保护作用研究取得了一定的进展,但IGF-1作为缺血､缺氧脑损伤保护剂的作用机制研究尚不充分[3-4]｡本实验以体外原代培养的新生大鼠脑皮层神经元建立类缺血､缺氧细胞模型,研究IGF-I对神经元缺血､缺氧损伤的保护作用,进一步探讨IGF-1在HIBD病理生理过程中的调控机制｡

1 材料与方法

1.1 材料 重组人胰岛素样生长因子-1(recombinant human insulin-like growth factor-1,rhIGF-1)购自Sigma公司,胰岛素样生长因子受体抑制剂(AG1024)购自Calbiochem公司,Neurobasal培养基及胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购自Invitrogen公司,微管相关蛋白-2(microtubule associated protein-2,MAP-2)､c-Jun 氨 基 端 激 酶 (c-Jun-NH2-terminal kinase,JNK)､p-JNK､P38､p-P38 抗 体 购 自 Abcam 公 司,ApoAlert Caspase Fluorescent Assay Kit购自BD Biosciences Clontech公司｡

1.2 方法

1.2.1 神经元缺血､缺氧模型的建立 在无菌条件下,取新生1dSD大鼠的大脑皮质,用Neurobasal培养基清洗,剪碎并通过40目不锈钢筛网过筛;将组织块置于0.25%胰蛋白酶中,振摇,37℃孵育消化10min后加FBS终止消化,过筛,滤液悬浮到Neurobasal培养基中,37℃､1 200r/min离心5min,去上清,清洗2次;沉淀加入含10%FBS的Neurobasal培养基中,轻轻吹打成单细胞悬液｡将细胞悬液接种到用10μg/mL多聚-L-赖氨酸包被的细胞培养瓶中,置5%CO2培养箱中孵育,隔日半量换液一次;培养4d后,换不含10%FBS的Neurobasal培养基,将培养瓶置于低氧培养箱中,氧浓度调为1%,模拟缺血､缺氧条件培养24h｡

1.2.2 实验分组 将同批培养的大鼠皮质神经元随机分为4组:(1)对照组(CON):正常培养皮质神经元;(2)缺氧､缺血组(HI);(3)rhIGF-1干预组(HII):于低氧培养箱内培养,无血清培养基中添加终浓度为100nmol/L的rhIGF-1,培养24h;(4)rhIGF-1与AG1024干预组(HIIA):于低氧培养箱内培养,无血清培养基中添加终浓度为100nmol/L 的rhIGF-1及10μmol/L的AG1024,培养24h｡

1.2.3 免疫组织化学观察rhIGF-1对模型细胞的影响 各组细胞干预后,弃培养液,用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)洗涤3次,4%多聚甲醛固定后进行 MAP-2免疫荧光染色｡

1.2.4 rhIGF-1对模型细胞活性的影响 细胞以5×105/mL转入96孔板,进入对数生长期后更换培养液,按实验分组加入干预因素,孵育24h后,加入10μL甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)(5mg/mL PBS贮存液),孵育4h,吸弃培养液,加入200μL二甲基亚砜,待颗粒溶解后放在酶标仪上,在490nm波长处检测各孔的吸光度｡

1.2.5 流式细胞仪分析 采用预冷PBS冲洗留取细胞2次,重悬细胞使细胞密度为1×106/L,取100μL细胞悬液,加入5μL异硫氰酸荧光素标记的AnnexinⅤ和10μL碘化丙啶(propidium iodide,PI)混匀,室温下避光孵育15min,每管内加入400μL结合缓冲液(1×),于1h内进行流式细胞分析｡激发波长为488nm,计数104个细胞｡所有数据均经Cell Qust软件收集处理｡

1.2.6 蛋白质印迹法(Western blotting)检测 取各组细胞,弃培养液,用预冷的PBS清洗3次,100mm平皿加200μL或300μL细胞裂解液,冰面上裂解20min,15 000r/min,4℃离心10min,取上清液,Bradford法进行蛋白定量(Bio Radproteinassay)｡以10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,半干电转移法转移至硝酸纤维素膜,室温下用封闭液封闭2h后加入一抗(JNK､p-JNK､P38､p-P38抗体),1∶1 000稀释,4℃孵育过夜,抗兔IgG二抗(1∶1 000稀释)反应2h,化学发光法显色,X射线底片曝光｡实验重复3次,β-actin作为内参照｡

1.2.7 Caspase-3蛋白活性检测 分组收集细胞(2×106);用预冷的PBS洗2次后,加入Caspase-3裂解液,冰浴10min后,4℃离心(12 000r/min,10min);取上清液,用考马斯亮蓝法(Bradford法)检测上清液中的蛋白质浓度;50μL Caspase底物于37℃､避光孵育4h;用酶标仪在405nm波长处检测吸光度｡

1.3 统计学处理 所有数据均以±s表示,应用SPSS13.0统计软件进行分析,组间比较采用单向方差分析法检验,P0.05表示差异有统计学意义｡

2 结 果

2.1 显微镜下观察各干预组细胞生长状态 见封3图1｡镜下观察发现HI组､HII组及HIIA组细胞数量较正常组明显减少｡HI组与HIIA组细胞数量比较,差异无统计学意义(P0.05)｡HII组的细胞数量高于 HI组,差异有统计学意义(P0.05)｡

2.2 rhIGF-1对模型细胞活性的影响 采用 MTT比色法检测rhIGF-1对模型细胞活性的影响,rhIGF-1对模型细胞有保护作用,细胞存活率明显升高｡HI组细胞活性明显下降,存活率为(67.83±5.28)%｡使用IGF-1干预模型细胞24h后,HII组细胞的存活率达到(77.00±3.80)%｡HIIA组细胞存活率为(62.00±4.40)%｡实验结果均重复6次,见图2｡

图2 rhIGF-1对模型细胞活性的影响

2.3 rhIGF-1对模型细胞凋亡的保护作用 采用FITC-AnnexinⅤ与PI双染流式细胞技术检测,实验结果显示,HI组细胞的凋亡率为27.10%(图3B);HII组凋亡率为14.58%(图3C);HIIA组凋亡率为24.97%(图3D)｡流式细胞仪结果显示,RHIGF-1对模型细胞有保护作用,能够降低HI组细胞的凋亡率｡

2.4 rhIGF-1对模型细胞JNK和P38表达的影响 本实验采用Western blotting检测了JNK和P38表达｡结果发现,在HI组中,p-JNK 和 p-P38表 达 上 调｡HII组 p-JNK 和 p-P38表达受到抑制｡实验均重复3次(见图4)｡

图3 rhIGF-1对模型细胞凋亡的保护作用

图4 rhIGF-1对模型细胞JNK和P38表达的影响

2.5 rhIGF-1对Caspase-3蛋白活性的影响 实验结果显示,与正常组相比较,HI组和 HIIA组Caspase-3活性达到(210.86±15.00)%､(203.32±34.00)%,HII组 Caspase-3活性受到抑制,结果差异具有统计学意义｡实验结果均重复6次(见图4)｡

图5 rhIGF-1对Caspase-3蛋白活性的影响

3 讨 论

近年来,实验研究认为IGF-1对神经元缺血､缺氧具有一定的保护作用,但作用机制还未完全明确｡通过MTT及免疫组化观察发现IGF-1可增加缺血､缺氧神经元的存活率,显现出明确的神经保护作用,这也与他人的研究结果相一致[5]｡IGF-1是一种有效的神经保护剂,在成熟脑组织中有广泛的低水平表达,它可以调节神经细胞的生长和分化,抑制细胞凋亡,对细胞受损后的恢复也有重要作用[6]｡流式细胞仪检测发现外源性给予IGF-1,可以有效抑制缺血､缺氧神经元的凋亡率,并且 Western blotting检测证实与下调p-JNK､p-P38的表达及抑制Caspase-3的活性有关｡AG1024是IGF-1受体抑制剂,可以明显抑制IGF-1对缺血､缺氧神经元的保护作用,证实了IGF-1的神经保护作用,且该保护作用与调节JNK､P38信号途径有关｡

丝裂原活化的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)是一类由脯氨酸介导的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,通过Ⅷ区域双位点的磷酸化而活化,MAPK超家族包括细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinases,ERKs)､p38 MAPK(p38mitogen activated protein kinase)､JNK 和应激活化蛋白激酶(stress activated protein kinases,SAPKs)等信号转导途径｡缺血､缺氧脑损伤可通过一系列信号途径转导至细胞核,启动相关基因表达,引起神经元凋亡｡有研究表明,缺血､缺氧脑损伤可激活JNK､p38信号途径[7]｡在本实验中,发现缺血､缺氧细胞模型中,p-JNK与p38水平升高,IGF-1对其有抑制作用｡同样,在诱导细胞凋亡的分子机制中,Caspase家族起着关键作用,它是一组在细胞凋亡过程中起着关键作用的酶｡Caspase为半胱氨酸天门冬氨酸蛋白,是一组具有相似的氨基酸顺序和二级结构的半胱氨酸蛋白酶,与真核细胞凋亡密切相关,还参与细胞因子的成熟､细胞生长和分化｡在Caspase家族成员中,Caspase-3对凋亡的进程起着决定性作用[8]｡Caspase-3被认为是细胞凋亡的执行者,是蛋白酶级联反应的关键环节｡本次研究发现,缺血､缺氧细胞模型中Caspase-3的活性升高,说明Caspase-3参与了神经细胞的凋亡,给予IGF-1后,Caspase-3的活性有明显改变｡其可能的机制是,缺血､缺氧诱导神经元增加了p-JNK与p38的表达,从而启动内源性途径激活Caspase家族,致使Caspase-3活性增高,最终神经元凋亡发生,而IGF-1可干预该途径,最终达到抑制神经元凋亡的作用｡

综上所述,尽管IGF-1抑制神经元凋亡的调控机制尚未完全阐释清楚,可能还存在许多未知的信号途径和调控基因在发挥作用,但随着对IGF-1与细胞凋亡研究的不断深入,IGF-1有可能被作为靶点为HIBD的治疗开辟新的途径｡

[1] Li L,Qu Y,Li J,et al.Relationship between HIF-1αexpression and neuronal apoptosis in neonatal rats with hypoxia-ischemia brain injury [J].Brain Res,2007,1180:133-139.

[2] Castillo A,Tolón MR,Fernández-Ruiz J,et al.The neuroprotective effect of cannabidiol in an in vitro model of newborn hypoxic-ischemic brain damage in mice is mediated by CB2and adenosine receptors[J].Neurobiol Dis,2010,37(2):434-440.

[3] Górecki DC,Beresewicz M,Zabtoocka B.Neuroprotective effects of short peptides derived from the insulin-like growth factor 1[J].Neurochem Int,2007,51(8):451-458.

[4] Beresewicz M,Majewska M,Makarewicz D,et al.Changes in the expression of insulin-like growth factor 1variants in the postnatal brain development and in neonatal hypoxia-ischaemia[J].Int J Dev Neurosc,2010,28(1):91-97.

[5] Lin S,Rhodes PG,Cai Z.Whole body hypothermia broadens the therapeutic window of intranasally administered IGF-1in a neonatal rat model of cerebral hypoxia-ische mia[J].Brain Res,2011,1385:246-256.

[6] Rubovitch V,Edut S,Sarfstein R,et al.The intricate involvement of the insulin-like growth factor receptor signaling in mild traumatic brain injury in mice[J].Neurobiol Dis,2010,38(2):299-303.

[7] 高歌,龙彩瑕,高亚南,等.低氧预适应升高小鼠脑内JNK磷酸化水平和蛋白表达[J].基础医学与临床,2006,26(2):141-142.

[8] Li J,Han B,Ma X,et al.The effects of propofol on hippocampal caspase-3and Bcl-2expression following forebrain ischemia-reperfusion in rats [J].Brain Res,2010,1356:11-23.

Influence of IGF-1 on p-JNK,p-P38 in hypoxia ischemia neurons of rat

,,,
(,,,570208,)

ObjectiveTo investigate the anti-apoptosis protective effects of insulin-like growth factor-1(IGF-1)on hypoxia ischemia neurons of rats and its action mechanism.MethodsCortical neurons were cultured,and made hypoxia ischemia cell model.Hypoxia ischemia cells were incubated with IGF-1or AG1024to study cell viability(MTT),apoptosis(Flow cytometry),JNK and P38expression(Western blot),and Caspase-3activation(fluorometric method).ResultsHypoxia ischemia cells were exposed to IGF-1or AG1024for 24h,and MTT assay showed that the cell survival rates of IGF-1(HII group)and AG1024(HIIA group)were(77.00±3.80)%and(62.00±4.40)%,respectively.The percentage of apoptotic cells was 14.58%and 24.97%,respectively.The expression of p-JNK,p-P38and Caspase-3activation were inhibited by IGF-1.ConclusionIGF-1protects neurons against hypoxia ischemia cells injure by inhibiting the expression of p-JNK,p-P38and caspase-3activation.

insulin-like growth factorⅠ;hypoxia-ischemia,brain;neurons;JNK mitogen-activated protein kinases;caspases

10.3969/j.issn.1671-8348.2012.16.005

A

1671-8348(2012)16-1572-03

2011-10-06

2011-12-20)

•基础研究•