噬菌体疗法治疗大肠埃希菌感染的研究现状及应用前景*

刘 平,邬亭亭,彭 丽,郭述良 综述,罗永艾审校

(重庆医科大学附属第一医院 400016)

噬菌体疗法治疗大肠埃希菌感染的研究现状及应用前景*

刘 平,邬亭亭,彭 丽,郭述良 综述,罗永艾△审校

(重庆医科大学附属第一医院 400016)

细菌噬菌体;埃希菌属;治疗应用

大肠埃希菌(Escherichia coli)是医院获得性感染常见致病菌,在临床分离的致病菌中仅次于铜绿假单胞菌,排在第2位,主要引起呼吸道､泌尿道､伤口､胆道感染,腹膜炎､败血症及脑膜炎等｡近年来细菌流行病学监测结果表明,大肠埃希菌耐药率逐年上升,已成为临床治疗面临的一大难题[1]｡

噬菌体(bacteriophage,phage)是感染细菌､真菌､放线菌和螺旋体等微生物的病毒的总称,分布极广,凡是有细菌的场所,就可能有相应噬菌体的存在｡裂解性噬菌体侵入宿主细胞后,随即引起宿主细胞裂解,利用这一特性可以用于治疗感染性疾病｡自发现噬菌体以来,研究者就尝试采用噬菌体治疗细菌性感染｡近年来,由于各种耐药性病原菌出现,新型抗生素的研发越来越困难,同时,随着大量噬菌体基因组的测序,研究者对噬菌体的进化史､噬菌体和宿主间相互作用､噬菌体生态学有了更深的了解,噬菌体疗法的知识背景和技术手段逐渐成熟以及噬菌体作为一种抗菌剂,具有特异性强､自我增殖快､来源广等一些其他抗菌剂无法比拟的优点,噬菌体疗法成为抗耐药菌研究领域的新热点[2]｡研究者报道了一系列应用噬菌体治疗大肠埃希菌感染的研究,来观察噬菌体治疗感染性疾病,特别是抗生素耐药菌导致的感染性疾病的潜力｡采用噬菌体疗法的动物实验可以明确噬菌体在大肠埃希菌感染中的治疗潜力并探寻最佳治疗方案,是噬菌体疗法用于人体前非常关键的一步｡现就相关文献进行综述｡

1 噬菌体治疗大肠埃希菌感染的潜力

目前研究者报道了一系列应用噬菌体治疗大肠埃希菌导致的小鼠､肉鸡､牛､羊羔､猪等动物的腹泻､呼吸道感染､败血症及脑膜炎等的研究成果｡大多数研究报道噬菌体能减少动物荷菌量,降低病死率,延长生存期,甚至能治愈大肠埃希菌感染[3-18]｡Smith､Huggins[4]发现产β-内酰胺酶的大肠埃希菌感染小鼠后立即用噬菌体Φ9882治疗,24～168h小鼠存活率为100%,而生理盐水对照组存活率为0｡研究发现噬菌体SPR02､DAF06可降低感染大肠埃希菌的肉鸡的病死率,当噬菌体剂量为108噬斑形成单位(plaque forming units,PFU)时病死率为0[11-17];Smith等[9]甚至发现低剂量105PFU 的噬菌体B85/1､B85/2,单次给药也能治愈小牛大肠埃希菌导致的腹泻｡噬菌体除用于治疗外,还能预防性应用,预防动物遭受大肠埃希菌的感染｡比如将102PFU噬菌体喷洒于牛圈中,或将小牛安置于接受过噬菌体治疗的小牛曾生活过的牛圈中,即对新生小牛具有保护作用[9]｡Huff等[11]也发现先用噬菌体喷雾给药7d后,再用大肠埃希菌感染肉鸡,噬菌体预防组肉鸡病死率较对照组下降｡

但是少数实验并未观察到噬菌体具有治疗作用,或者动物荷菌量短暂降低后又恢复到对照组水平[19-23]｡Stanford等[21]报道将噬菌体包入聚合物胶囊,或者掺入饲料中经口给药可以减轻噬菌体被胃酸失活,但是牛体内的大肠埃希菌荷菌量并没有减少｡研究发现噬菌体能减少羊肠内大肠埃希菌荷菌量,但没有根除病原菌[20-21]｡还有研究发现未用噬菌体处理的对照组体内也检出噬菌体,并且体内检出的噬菌体滴度与直肠给药组相近,口服给药组､直肠给药组､口服和直肠给药组以及对照组荷菌量无明显差异[22]｡

噬菌体疗法对不同动物的大肠埃希菌感染疗效有所不同｡噬菌体疗法对小鼠､肉鸡大肠埃希菌感染有较好疗效,并能预防其遭受大肠埃希菌感染,而对大肠埃希菌导致的羊和牛的腹泻疗效不确切[3-24],有的实验发现噬菌体能治愈大肠埃希菌导致的羊和牛的腹泻,而有的实验却发现噬菌体治疗组和空白对照组疗效无差异[8-23]｡Stanford等[21]发现同一噬菌体 对小鼠腹泻疗效好,对羊的腹泻却疗效欠佳｡

2 影响噬菌体疗法疗效的因素

2.1 给药方式

2.1.1 给药途径 噬菌体治疗大肠埃希菌感染给药途径有噬菌体掺入饮用水给药､灌胃､直肠给药､腹腔注射､雾化吸入､肌肉注射等,不同给药途径的治疗效果不同｡噬菌体掺入饮用水中给药对不同部位的感染疗效不同,对呼吸道感染无治疗作用[12],但长期给药能降低腹泻小鼠肠道荷菌量[23]｡灌胃给药途径对治疗大肠埃希菌导致的小鼠､肉鸡腹泻疗效好,而对羊和 牛的腹泻疗 效 不 一[8-9,19-24],这 是 否 与 食 草 动 物 特 殊 而 发 达的多室胃导致噬菌体失活有关,还有待进一步验证｡经直肠给药疗效与灌胃相近[22-23]｡腹腔注射给药治疗小鼠大肠埃希菌感染疗效好[3,6]｡Huff等[13,15]研究发现雾化给药能保护呼吸道感染大肠埃希菌的肉鸡,不能保护全身感染的肉鸡,而肌内注射给药治疗效果好,肉鸡全身感染大肠埃希菌后48h,噬菌体肌内注射给药也能挽救重度感染的肉鸡｡雾化吸入噬菌体比肌内注射给药治疗全身感染效果差,可能与雾化吸入给药,血液中不能达到噬菌体高滴度有关｡雾化给予噬菌体1h后血液里能检测到少量噬菌体(96PFU/mL),而肌内注射给予噬菌体6h后血液里也可检测到大量噬菌体(104PFU/mL)[3]｡总的来说,对于全身性感染,全身给药疗效优于局部给药｡

2.1.2 给药剂量 大多实验性感染中,噬菌体治疗效果与噬菌 体 滴 度 相 关 ,滴 度 高 治 疗 效 果 好[15-16,24]｡Huff等[12,15-16]研究发现小鼠感染大肠埃希菌后立即给予与细菌等量(6×104PFU)的噬菌体SPR02､DAF6,可以使病死率从85%降至35%,而给予108PFU噬菌体时小鼠死亡率为0｡Oliveira等[24]研究发现给予107PFU噬菌体F78E时治疗无效,而109PFU噬菌体F78E能使治疗组肉鸡发病率和病死率分别降低43%和25%;当应用噬菌体鸡尾酒制剂(F78E､phi F258E､phi F61E)治疗时,低剂量(107PFU)即可在3周内控制感染,未发现有复发病例｡但是Smith等[9]发现低剂量的噬菌体也有很好的疗效:低剂量105PFU单次给药能治愈大肠埃希菌导致的腹泻;将102PFU噬菌体喷洒于牛圈中,或将小牛安置于接受过噬菌体治疗的小牛曾生活过的牛圈中,即对新生小牛具有保护作用｡这可能与每株噬菌体的生物学特性不一､杀灭宿主菌的能力不同有关,说明噬菌体治疗没有普遍适用的应用条件,每种噬菌体用于治疗感染性疾病前均需要寻找最佳的给药方案｡

2.1.3 给药频率 噬菌体治疗大肠埃希菌感染连续给药比单次给药治疗效果好｡噬菌体单次给药能使粪便中的噬菌体短暂下降,9d后噬菌体给药组和未处理组荷菌量差别不大,连续每日给药后,能快速减少小鼠胃肠道的荷菌量,粪便里能检测到高滴度的噬菌体[19]｡小鼠感染大肠埃希菌后,第0､1､2天连续肌内注射噬菌体,可治愈所有感染的肉鸡;单次肌内注射能降低肉鸡病死率,但不能治愈所有肉鸡[17]｡

2.1.4 给药时间 各种噬菌体治疗时间窗不同,大多数实验表明感染大肠埃希菌后立即用噬菌体治疗效果佳,能减少动物荷菌量,降低死亡率,延长生存期,甚至治愈,延迟治疗会导致疗效差,甚至治疗失败[17-18]｡Wang等[3]发现大肠埃希菌感染后延迟60min给予噬菌体治疗,小鼠168min存活率降至60%;Bull等[5]发现延迟给药会导致难治性感染;但是Barrow等[10]发现在延迟至鸡出现临床症状时再给予噬菌体治疗仍能预防败血症和脑膜炎｡在感染大肠埃希菌前预防性应用噬菌体,可预防病原菌感染,保护时间窗各不相同,从1d至1周不等,可能与噬菌体本身的免疫原性有关,易诱导机体产生中和抗体的噬菌体预防时间窗短,而免疫原性低的噬菌体保护时间窗长[18,25]｡

不同给药途径的治疗时间窗也不同,肌内注射的治疗时间窗长于雾化吸入[10]｡肉鸡感染大肠埃希菌后立即噬菌体雾化给药,可降低肉鸡病死率,延迟至24､48h时给药无治疗作用,而延迟至48h肌内注射给予噬菌体也能降低肉鸡病死率｡这可能与雾化给药途径噬菌体不能有效到达感染部位有关[13]｡

2.2 噬菌体抗性 噬菌体与宿主之间存在着防御和反防御的相互作用,宿主菌已经建立了击退噬菌体在其生活周期中的几乎所有阶段对它发生毒性攻击的方法,即产生了噬菌体抗性(bacteriophage resistance)[26]｡Tanji等[19]发现噬菌体和大肠埃希菌共培养时能使培养基浊度降低,但继续培养,噬菌体抵抗的病原菌增多,导致浊度又增加｡分离出的噬菌体抵抗细菌,对某一噬菌体抵抗的细菌对另一种噬菌体仍然敏感｡噬菌体治疗无效死亡的小牛小肠内有大量的噬菌体抵抗的大肠埃希菌[8]｡分离的噬菌体抵抗变异株多为k1阴性菌,毒性下降,且易恢复对噬菌体的敏 感性[4-5,8-9]｡少数分离 的菌为 k阳 性菌,k1阴性菌和阳性菌在培养基中增殖速率相近,但k1阳性菌在小鼠血清中增殖速率较快,毒力无下降[5,9],多株大肠埃希菌混合感染的小牛体内很快可以分离出新的噬菌体变异株,这株新噬菌体可以控制噬菌体抵抗株的感染[9]｡

2.3 机体对噬菌体的清除 噬菌体可以在机体内繁殖[10],但同时噬菌体具有免疫原性,进入机体后会被机体免疫系统清除,不同噬菌体在体内存活时间不同｡在用噬菌体治疗大肠埃希菌感染前,动物暴露于噬菌体,会影响噬菌体治疗效果,可能与机体产生中和抗体有关[18,25]｡Huff等[18]发现感染大肠埃希菌后立即给予噬菌体治疗,可降低肉鸡病死率,病死率与未感染大肠埃希菌的对照组无差别,而先肌内注射噬菌体7d后再用大肠埃希菌感染肉鸡,肉鸡病死率与未治疗对照组无差别,该组肉鸡血清能降低噬菌体活性,IgG含量比未用噬菌体处理的对照组高｡

2.4 噬菌体鸡尾酒制剂 噬菌体鸡尾酒制剂治疗大肠埃希菌感染疗效较好[24-25]｡Tanji等[19]研究发现3种噬菌体 SP15､SP21､SP22单独应用时能使培养基浊度降低,但继续培养,噬菌体抵抗的大肠埃希菌增多,导致浊度又增加;在有氧条件下,3种噬菌体联用时培养基浊度降低后没有再增加｡但是某些单一噬菌体也能达到鸡尾酒制剂的治疗效果[23]｡单一噬菌体治疗效果与噬菌体滴度相关,107PFU噬菌体F78E治疗无效,109PFU噬菌体F78E能使治疗组肉鸡发病率和病死率分别降低43%和25%;大规模动物实验发现低剂量(107PFU)鸡尾酒制剂(F78E､phi F258E､phi F61E)可在3周内控制大肠埃希菌感染,未发现有复发病例[24]｡

2.5 噬菌体和抗生素联用 噬菌体和抗生素治疗效果比较,噬菌体优于部分抗生素,两者联用效果较佳｡噬菌体单次给药治疗大肠埃希菌感染比多次给药的四环素､氨苄青霉素､氯霉素､复方新诺明疗效好,与链霉素疗效相近[4]｡恩氟沙星使肉鸡病死率从68%降至3%,而噬菌体治疗组病死率为15%,两者联合应用无肉鸡死亡[14]｡

3 噬菌体疗法的不良反应

目前发表的研究未发现噬菌体疗法有明显的不良反应｡Nishikawa等[6]发现单独接种噬菌体未产生对机体的不利反应｡Huff等[14]发现恩氟沙星治疗组肉鸡肺泡损伤较噬菌体组治疗轻｡

4 噬菌体疗法前景展望

研发噬菌体防治细菌性感染比研发新的抗生素具有一些优势:(1)噬菌体特异性强,通常仅针对宿主菌,不会干扰机体内正常的菌群平衡;(2)噬菌体在细菌感染或污染的部位可以快速增殖,给药剂量得到放大,增强疗效;(3)噬菌体几乎没有毒性反应,机体内本身就寄居着种类繁多的噬菌体,特别是在胃肠道区域;(4)噬菌体可以再侵染噬菌体抗性菌株,某一种噬菌体抗性菌株可以被其他具有类似抗菌范围的噬菌体裂解,某些噬菌体还可以随着抗性菌株的产生而变异,可以重新裂解变异菌株;(5)筛选新的噬菌体治疗细菌感染,时间相对较短,通常可在数天或数周之内完成,而且进化论认为通过自然选择的不断筛选,噬菌体能够治疗耐受抗生素和噬菌体的细菌感染｡

噬菌体疗法是个体化的治疗,很难像抗生素抗感染一样给出标准化的治疗方案｡本文综述的22个研究中,使用了16株大肠埃希菌和49株噬菌体,这些大肠埃希菌致病力有差异,噬菌体的生物学特性和实验条件也各不相同,这造成实验彼此之间可比性差｡有些实验,给药时间延迟数小时,噬菌体疗法的疗效就变差,但有些实验给药时间延迟数天,疗效也没有差别｡某些噬菌体显示出优于其他噬菌体的特性,比如噬菌体SH1单独应用和鸡尾酒疗法(噬菌体SH1､KH1联用)疗效相当[20];噬菌体phi1静脉注入小鼠体内后未检测到中和抗体,2周内均有抗菌活性[27];105PFU噬菌体单次给药即能治愈大肠埃希菌导致的腹泻[9]｡研究者通过噬菌体疗法的动物实验可以弄清噬菌体在大肠埃希菌感染中的治疗潜力,筛选出疗效好､免疫原性低的噬菌体用于治疗｡Merril等[8]使噬菌体在小鼠体内反复循环,筛选出噬菌体变异株,不仅能在体内长时间存活,而且对小鼠保护效力强于野生型噬菌体[28-29]｡

研究者已经应用噬菌体治疗人体的感染性疾病｡2005年,Bruttin等开展口服噬菌体人体安全试验,自愿者口服含有105PFU/mL大肠埃希菌噬菌体T4的水,所有受试志愿者未发现不良反应[30]｡许多噬菌体制剂公司也开展了噬菌体疗法人体试验,用于治疗耳炎､腿部溃疡和烧伤等｡2008年英国Biocontrol Ltd.公布了该公司主持进行的一项应用噬菌体治疗耐药铜绿假单胞菌中耳炎的双盲､安慰剂对照Ⅱ期临床试验的研究结果,24例患者中,噬菌体治疗组有50%的人症状改善,而对照组只有20%的人改善症状｡同时,噬菌体治疗组的患者治疗3周后耳部荷菌量减少80%,而对照组荷菌量稍有增加[2]｡2006年,美国FDA批准了一项噬菌体鸡尾酒制剂LMP-102TM用于防治即食肉制品的李斯特菌污染[2]｡波兰和前苏联地区应用噬菌体疗法的成功案例表明[2],在常规抗生素治疗失败后,应用噬菌体疗法治疗感染性疾病是一个可行的治疗手段｡

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10.3969/j.issn.1671-8348.2012.16.030

A

1671-8348(2012)16-1641-04

* 基金项目:国家“十一五”科技重大专项基金资助项目(2008ZX10303)｡△

,E-mail:luoyongail942@163.com｡

2011-11-08

2011-12-19)

•论 著•