盐酸法舒地尔对大鼠脑缺血再灌注神经元形态和Bax mRNA表达的影响

李媛媛 于永强 (河北北方学院附属第一医院神经内科，河北 张家口 075000)

盐酸法舒地尔对大鼠脑缺血再灌注神经元形态和Bax mRNA表达的影响

李媛媛 于永强 (河北北方学院附属第一医院神经内科，河北 张家口 075000)

目的 观察盐酸法舒地尔对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用。方法 健康雄性Wistar大鼠30只，体重220～260 g，随机分为模型对照组、盐酸法舒地尔治疗组，每组15只。大鼠10%水合氯醛麻醉后，颈动脉栓线法造模。盐酸法舒地尔治疗组分别于栓塞前、再灌注前5 min灌胃给药80 mg/kg;模型对照组灌胃等量麻油。各组均4 h后断头取脑，HE染色光镜下观察细胞形态，原位杂交检测不同组别Bax mRNA，电镜观察盐酸法舒地尔对大鼠脑缺血再灌注损伤神经元形态、亚细胞结构形态的影响。结果 模型对照组脑组织内血管扩张充血，结构紊乱，部分神经细胞胞体肿胀，可见中央型尼氏小体溶解，部分神经细胞核固缩，核仁缩小、甚至消失，神经胶质细胞增生，胶质细胞结节形成;而且神经细胞核双层膜结构不清，细胞核固缩溶解，核仁消失，线粒体水肿扩张;盐酸法舒地尔治疗组血管扩张减轻、细胞核双层结构清晰，线粒体肿胀减轻;而且治疗组Bax阳性细胞平均数密度减小(P＜0.05)。结论 盐酸法舒地尔对大鼠脑缺血再灌注损伤有一定保护作用。

脑缺血再灌注;盐酸法舒地尔;细胞凋亡;Bax

脑血管疾病主要的病理过程是缺血缺氧，以及由此引起的缺血再灌注损伤。盐酸法舒地尔可以抑制平滑肌收缩而扩张血管，改善和预防由多种原因引起的脑血管痉挛，改善脑缺血症状及伴随的神经元损伤〔1〕。本实验研究盐酸法舒地尔的脑细胞保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

健康雄性Wistar大鼠30只，体重220～260 g，随机分为模型对照组、盐酸法舒地尔治疗组，每组15只。大鼠10%水合氯醛麻醉，暴露并分离左侧颈总动脉、颈外和颈内动脉，电凝颈外动脉的分支甲状腺上动脉、咽升动脉，结扎翼腭动脉。将前端涂有硅胶脂的尼龙线经颈外动脉插入颈总动脉，插入深度约(18±0.5)mm。选择苏醒后左上肢屈曲，行走时向左侧旋转或左侧肢体瘫痪的大鼠为栓堵成功者进行实验，否则视为栓堵失败，弃之。缺血90 min将栓线拉出至颈外动脉，再灌注120 min。盐酸法舒地尔治疗组分别于栓塞前、再灌注前5 min灌胃给药盐酸法舒地尔(商品名：川威，天津红日医药有限公司)80 mg/kg;模型对照组灌胃等量麻油。

1.2 方法

各组均4 h后断头取脑，在脑的视交叉后和下丘脑后横断(冠状面)，将脑分成前、中、后三部分，分别在前、中切面上常规中性甲醛固定，HE染色光镜下观察细胞形态;原位杂交检测不同组别Bax mRNA水平，试剂盒购于武汉博士德公司，严格按试剂盒说明书操作。同时取部分皮质制作超薄切片，电镜观察神经元形态、亚细胞结构形态。选取Bax mRNA阳性表达典型区域，细胞核染成棕黄色为阳性细胞，计数10个400倍镜下阳性细胞数，取均值。

1.3 统计学分析

采用SPSS10.0软件进行t检验。

2 结果

2.1 光镜观察

模型对照组皮质部分神经细胞核固缩、着色加深，有些细胞核、质界限不清;血管周围和神经元周围水肿带明显增宽(由于脑组织水肿所致)，水肿带宽度分别为(10.55±2.37)mm、(5.76±2.80)mm。盐酸法舒地尔治疗组皮质神经元大部分结构清晰、受损神经元明显减少，血管周围及神经元周围水肿带宽度分别为(4.60±1.06)mm、(3.15±1.47)mm;两组水肿带宽度具有统计学差异(P＜0.05)。

2.2 电镜观察

模型对照组：双层膜结构不清，细胞核固缩溶解、核仁消失，线粒体水肿扩张，神经元核内异染色质增多，内质网、核糖体、线粒体等减少，血管及胶质膜水肿。盐酸法舒地尔治疗组：双层膜结构相对清晰，细胞核固缩少见，核仁可见，神经元异染色质少，细胞器较规整，基膜相对清晰。

2.3 不同组别神经元Bax mRNA表达的变化

模型对照组皮质神经元呈棕黄色，着色深，而且阳性细胞密集，以血管周围为主，阳性细胞数为(76±12)个/GHF。盐酸法舒地尔治疗组皮质神经元呈浅棕黄色，阳性细胞密度较模型组减低(P＜0.05)，以血管周围为主，阳性细胞数为(45±10)个/GHF。

3 讨论

多种能造成脑组织缺血缺氧的原因，均可引起缺血缺氧脑病，早期可引起脑组织神经胶质细胞增生，神经细胞急性坏死。而缺血区域侧支循环建立以后或损伤脑组织血供恢复以后，由于氧自由基生成、细胞内钙超载、一氧化氮合成、兴奋性氨基酸增加、脂质过氧化、氧化应激等毒性作用触发细胞凋亡，造成神经细胞从基因开始死亡，其中血管再通后引起的神经细胞迟发性坏死是神经系统缺血缺氧脑病最主要的危害原因〔1～3〕。并不是所有的缺血均可引起脑细胞缺血再灌注损害。常见的原因有：(1)再灌注损伤与缺血时间密切相关，再灌注损害不会发生于过长或过短的缺血时间。(2)侧支循环建立时间短、建立完善者，再灌注损害不易发生。(3)缺氧可损伤线粒体、细胞色素氧化酶系统功能，而氧自由基增多、线粒体钙超载可使超氧化物歧化酶减少，减少自由基的清除，进一步造成细胞及细胞器的损害。

脑缺血再灌注损伤可导致细胞膜、核膜及细胞器膜通透性改变，酸钙离子进入细胞器内，造成下列危害：(1)突触前兴奋性氨基酸谷氨酸及 N-甲基-D-天门冬氨酸释放，引起受体依赖的Ca2+内流。(2)缺血时激活磷脂酶A2，造成膜磷脂降解，游离的花生四烯酸增多。再灌注后，花生四烯酸进一步代谢成前列腺素类、白三烯类和血小板激活因子，并启动膜脂质过氧化，形成脂性自由基，从而促进钙受体通道兴奋性氨基酸的释放。(3)激活蛋白酶、核酸内切酶，导致微管解聚，细胞骨架破坏，从而造成神经元死亡。(4)膜蛋白质过度磷酸化、神经细胞线粒体滞留钙作用降低、有神经细胞毒性的兴奋性谷氨酸释放增多，造成神经元迟发性死亡〔4，5〕。本实验结果说明盐酸法舒地尔对平滑肌的舒张作用可以减轻再灌注导致的损伤，可能通过干预促凋亡基因表达而发挥治疗作用。

1 Murabayashi M，Minato M，Okuhata Y.Kinetics of serum S100B in newborns with intracranial lesions〔J〕.Pediatr Int，2008;50(1)：17-22.

2 Barks JD.Current controversies in hypothermic neuroprotection〔J〕.Semin Fetal Neonatal Med，2008;13(1)：30-4.

3 Margolin E，Gujar SK，Trobe JD.Isolated cortical visual loss with subtle brain MRI abnormalities in a case of hypoxic-ischemic encephalopathy〔J〕.J Neuropathalmol，2007;27(4)：292-6.

4 Rhodes H.Breaking down privacy and security barriers to HIE〔J〕.J AHIMA，2007;78(10)：68-9.

5 Zanelli SA，Naylor M，Dobbins N.Implementation of a Hypothermia for HIE program：2-year experience in a single NICU〔J〕.J Perinatol，2008;28(3)：171-5.

R743

A

1005-9202(2012)23-5220-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.23.054

李媛媛(1972-)，女，主管护师，主要从事临床神经疾病研究。

〔2012-03-22收稿 2012-07-10修回〕

(编辑 曲 莉)