乳酸杆菌S-层蛋白研究进展

北京大北农科技集团股份有限公司

饲用微生物工程国家重点实验室 王 凡 李晓清 刘 婷 王安如＊

大量研究证实乳酸杆菌制剂对促进动物生长、增强抗病力、调节免疫机能等方面均有较好的作用效果。乳酸杆菌与宿主细胞的黏附是乳酸菌发挥生理作用的基础，通过黏附于肠上皮细胞表面，定植形成稳定的菌群，抑制病原菌对宿主的定植、移位和感染，维护肠黏膜的完整性，保护宿主肠道上皮细胞免受侵袭，而且黏附于肠道的益生菌可起到免疫调节作用，维持肠道健康高效的生理功能。

细菌的黏附可分为特异性黏附和非特异性黏附（Ofek等，1994）。特异性黏附是通过细菌与黏膜上皮细胞受体的结合；非特异性黏附则是通过疏水、静电等进行作用。早期的研究发现，乳酸杆菌细胞壁中的脂磷壁酸（lipoteichoic acid，LTA）和细胞外多糖（EPS）参与了乳酸杆菌和宿主细胞之间的黏附，其中LTA起主要作用 （Granato等，1999），近年来的研究多集中在乳酸杆菌中介导黏附的表面蛋白（Rinkinen等，2003）。其中研究较为清楚的是 S-层蛋白（S-layer protein，SLP），目前普遍认为S-层蛋白是乳酸菌的黏附素之一，本文就乳酸杆菌S层蛋白的结构、生物学功能、应用等方面作一综述。

1 乳酸菌S-层蛋白的结构与性质

S-层蛋白广泛存在于古细菌和真细菌表面，是由蛋白质组成的晶格状结构，位于细胞壁或细胞膜外层，其中乳酸菌S-层蛋白分子质量为40～71 kDa，是目前已知分子质量最小的S-层蛋白，占菌体总蛋白的10%～15%，一般疏水性氨基酸占31.9%～38.7%，含有大量谷氨酸和天冬氨酸（15%），赖氨酸含量也相当高（10%），极少存在含硫氨基酸 （孙明等，2002；Sara和Sleytr，2000）。 高等电点（PI为 9.35 ～ 10.4）是乳酸菌 S-层蛋白的最大特征（Sleytr 和 Sára，1997；Bro..ckl等，1991）。乳酸杆菌S-层蛋白的同源性主要集中于C端，该区域主要负责蛋白对细胞外膜的锚定作用，而N端的区域主要与蛋白的自身组装及对细胞的黏附作用相关，变异较大（Sára等，1994）。S-层蛋白二级结构分析表明，20%的氨基酸构成α-螺旋，40%为β-折叠，β-转角与非周期性折叠为5%～45%。许多古菌和G+细菌的S-层蛋白被糖基化，可与糖链共价结合，在有些S-层蛋白中还有磷酸化修饰作用（Schaffer 和 Graninger2001；Messner 等 ，1997）。乳酸菌中只有布氏乳杆菌（L.buchneri）发现具有多聚糖结构（Fogh等，1997）。但是大多数乳杆菌S-层蛋白未发现类似结构 （Darfeuille-Michand等，1990）。目前，研究表明，S-层蛋白存在于许多乳杆菌中，如短乳杆菌（L.brevis）、瑞士乳杆菌（L.helveticus）、嗜酸乳杆菌（L.acidophilus）、卷曲乳杆菌（L.crispatus）和（L.gallinarum）等，而约氏乳杆菌（L.johnsonii）和格氏乳杆菌（L.gaserri）等被称为B群嗜酸乳杆菌的一类乳酸菌并不含有S-层蛋白 （Hagen 等，2005，Boot等 1996b；Boot等，1996a）。

2 乳酸菌S-层蛋白基因

目前，只有少数乳酸杆菌的S-层蛋白基因被克隆并测序，如短乳杆菌 （L.brevis）（Vidgren等，1992）、 嗜酸乳杆菌 （L.acidophilus）（Boot和Kolen，1993）、 瑞士乳杆菌 （L.helveticus）（Callegari等，1998）和卷曲乳杆菌（L.crispatus）（Sillanp a..a..等，2000）等。一些乳酸杆菌的SLP基因已被收录在 GeneBank数据库中。有研究发现，乳酸菌中普遍存在多个S-层蛋白基因，如短乳杆菌（L.brevis）ATCC 14869就含有 3个 S-层蛋白基因：slpB、slpC 和 slpD（Vidgren等，1992）。 嗜酸菌乳杆菌都具有两个S-层蛋白基因，如嗜酸乳杆菌 （L.cripatus）ATCC 4356 和 卷 曲 乳 杆 菌 （L.crispatus）JCM 5810，其中一个基因可在细菌中得到表达，而另一个则为沉默型 （Boot等，1996b；Boot等，1995；Boot和 Kolen，1993）。 陈雪燕（2007）利用 RT-PCR、Western blot 和 ELISA等技术对卷曲乳杆菌 （L.crispatus）ZJ001的研究也表明，该菌含有两个S-层蛋白基因，slpA与slpB基因，slpB为沉默基因。同时，不同的乳酸菌具有不同的S-层蛋白基因结构。嗜酸乳杆菌（L.cripatus）ATCC 4356中的两个slp基因间隔3 kb，并且在slp基因片段中处于相对的位置（Avall-Ja..a..skela..inen 等，2002）；短乳杆菌（L.brevis）ATCC 14869中的 slpB与 slpC相邻，而离slpD 较远（Jakava-viljanen 等 ，2002）；卷曲乳杆菌 （L.crispatus）ZJ001的 S-层蛋白基因 slpA和slpB位于长约9.0 kb的slp片段上，间隔约4.5 kb。

嗜酸乳杆菌（L.acidophilus）、卷曲乳杆菌（L.crispatus）和瑞士乳杆菌（L.helveticus）的 slp 在 C端区域有着高度的相似性，而在N端区域变化很大（Sillanpa..a..等，2000）。 然而，嗜酸乳杆菌（L.acidophilus）和瑞士乳杆菌（L.helveticus）的 slp 在整个序列都表现着高度的相似性。嗜酸乳杆菌（L.acidophilus）、卷曲乳杆菌（L.crispatus）和瑞士乳杆菌（L.helveticus）的信号序列相似水平很大。DNADNA杂交试验证实，分类上相近的乳酸杆菌，其S-层蛋白序列也存在一定的同源性 （Boot和Pouwels，1996c）。 布 氏 乳 杆 菌 （L.buchneri）DSM 20057的染色体和短乳杆菌（L.brevis）ATCC 14869的slpA基因DNA之间具有很强的杂交信号，表明前者含有slpA同源序列。

3 S-层蛋白的功能

目前，大部分乳酸杆菌S-层蛋白功能并不清楚，只有部分得到证实。已有的报道表明，S-层蛋白在对宿主细胞的黏附中起作用，而其中一些蛋白质能有效阻止致病菌对上皮细胞的黏附（Johnson-Henry 等，2007）。 L.brevis 14869 对猪的肠道上皮细胞也有很强的黏附力，但并未证实slpA是否参与了黏附过程。L.crispatus JCM 5810的S-层蛋白 Cbs A介导与肠下细胞外基质组分胶原质和层黏连蛋白的黏附（Antikanen等，2002）。 L.acidophilus M 92的 S-层蛋白介导细菌对猪肠道上皮细胞的黏附（Hynonen等，2005）。

有研究者利用Western Blot方法，研究辣根过氧化物（HRP）标记的黏蛋白受体与罗伊氏乳杆菌 JCM 1081表面蛋白的结果显示，存在于JCM 1081菌株细胞壁表面的两种蛋白 Mr 29000和 Mr 14000为乳杆菌 JCM1081的黏附相关蛋白。有研究表明，在陆生动物与水产动物中，乳酸菌的黏附具有菌种特异性，而无宿主特异性（Rinkinen 等，2003）。 陈营等（2006）利用黏液模型研究了从健康牙鲆肠道中分离筛选出的乳杆菌L15与嗜酸乳杆菌ATCC 4356表面蛋白中黏附相关蛋白的种类，蛋白质印迹结果显示，L15表面蛋白中分子质量为61.8 kDa和54.6 kDa的蛋白质分别参与对牙鲆和鲤鱼黏液的黏附过程，ATCC 4356中分子质量分别为43.0 kDa和63.3 kDa的两个表面蛋白参与对牙鲆黏液的黏附，而分子质量为43.0 kDa的蛋白参与对鲤鱼黏液的黏附。同时，肠黏液中参与黏附的蛋白质种类不随着乳杆菌种类的改变而改变，但是相应的细菌表面参与黏附的蛋白质会随着肠黏液种类的变化而有所不同。陈雪燕（2007）从猪肠道分离具有耐酸耐胆盐和强黏附力的乳酸杆菌ZJ001，除去S-层蛋白后，ZJ001的自凝现象和对HeLa细胞的黏附力降低。同时，菌株ZJ001能竞争抑制鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌O157：H7对HeLa细胞的黏附，利用LiCl去除S-层蛋白后可降低ZJ001对病原菌黏附的拮抗作用，表明了S-层蛋白在ZJ001对病原菌黏附的拮抗中发挥了重要的作用。

4 S-层蛋白的应用

S-层蛋白在分子工程和生物材料上具有广阔的应用前景，例如，S-层可以开发成分子筛，也可作为功能分子共价吸附固定的基质，如酶和抗体、亲和膜、生物传感器以及固相免疫分析；利用分子遗传技术，可使外源蛋白得到表达，在细胞表面展示，从而开发基因工程疫苗、全细胞固定化酶等（Breitwieser等，1996）。现在已经成功地表达了某些生物活性蛋白或多肽在细胞表面，如利用芽孢杆菌slp展示了果聚糖蔗糖酶、α-淀粉酶、金属硫蛋白等（Mesnage等，1999）。

目前，关于乳酸杆菌slp基因的应用研究是利用其启动子或信号序列产生胞内或胞外异源蛋白。slpA基因的分泌信号已成功地应用于许多异源蛋白的分泌和输出（Savijoki等，1997）。研究表明，短乳杆菌（L.brevi）ATCC 8287及嗜酸乳杆菌（L.acidophilus）ATCC 4356的slpA基因的启动子在不同的乳酸杆菌中都能获得较高产量的胞内蛋白，但启动子的功能与所用的宿主和报告蛋白有关。另外，利用乳酸杆菌S-层蛋白的受体结合区域异源表层表达，可使不具有黏附力的乳酸杆菌转变为具有黏附力。将卷曲乳杆菌（L.crispatus）的cbsA蛋白结合到干酪乳杆菌（L.casei）细胞壁上，使其与干酪乳杆菌蛋白酶PrtP细胞壁分类信号联合，可使干酪乳杆菌黏附到胶原蛋白上，但其黏附力较野生型卷曲乳酸杆菌低。嗜酸乳杆菌 （L.acidophilus）ATCC 4356具有水解酶的活性，并且通过克隆使其在枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis）具有水解酶活性的C端进行表达，结果显示，表达后的蛋白具有水解酶活性（Mariano等，2008）。

5 展望

良好的定植能力是乳酸菌发挥生理作用的基础，乳酸菌表面黏附因子决定了乳酸菌能否发挥作用。通过研究S-层蛋白在乳酸菌对宿主细胞的黏附过程中的作用，为研究乳酸菌益生功能提供理论依据，并能为菌株的改造，提高益生菌株黏附性能提供方向。同时，由于S-层蛋白的空间结构和基因特点，使其在纳米生物材料、仿生学、基因工程疫苗、生物传感器等方面均得到应用。

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