齐墩果酸和去氧胆酸衍生物合成及抗血管生成活性研究

王鹏龙 程亚涛 汪 林 徐士勋 王艳慧 李 强 雷海民

(北京中医药大学中药学院中药化学系，北京100102)

本文以丙酮/K2CO3作为反应体系，利用溴代川芎嗪分别与齐墩果酸和去氧胆酸发生亲核取代反应，得到齐墩果酸和去氧胆酸衍生物，即齐墩果酸28-COOH和去氧胆酸24-COOH与丙酮基拼接的产物。有文献［1-3］显示齐墩果酸和去氧胆酸具有一定的抗血管生成活性，本课题组应用鸡胚绒毛尿囊膜(chorioallantoic membrane，CAM)模型初步评价了这2种化合物的在体血管生成活性。本研究是对中药活性成分的二次开发，不仅有助于解释中药组方配伍的科学内涵，也是对创新药物发现的有益探索。

1 材料和方法

1.1 仪器

X-5显微熔点测定仪(北京泰克仪器有限公司)，温度未经校正;1HNMR和13CNMR由AM-500核磁共振仪(瑞士Bruker公司)测定，CDCl3为溶剂，TMS为内标;IR谱采用 Nicolet iS10型红外光谱仪(美国Thermo公司)测定，KBr压片;微量振荡器(江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司)，解剖显微镜(日本Olympus公司320040型)。

1.2 试剂

川芎嗪(ligustrazine，TMP)(南京泽朗医药科技有限公司);齐墩果酸(oleanolic acid，OA)、去氧胆酸(deoxycholic acid，DA)(上海晶纯实业有限公司);NBS(日照力德士化工有限公司);吸附性明胶海绵(南京金陵制药厂);0.9%氯化钠注射液(北京双鹤药业)。

1.3 CAM模型及评价方法

CAM形成于胚胎早期，此时鸡胚机体的免疫系统尚未完全建立，对各种异物几乎不发生排斥反应，将含药载体置于其表面，可观察药物对血管生成的影响，该模型对抗血管生成药物敏感，目前被采用于药物筛选［4-5］。本文借助图像处理软件(Image Professional Plus 5.0)，以药物干预后CAM新生血管(＜100 μm)数目为指标，评价化合物对在体新生血管的生成活性。本实验采用德国罗曼鸡胚蛋，胚蛋由北京农业大学畜牧养殖场提供，蛋质量50～60 g。

1.4 齐墩果酸乙酰甲酯和和去氧胆酸乙酰甲酯的合成

1)溴代川芎嗪的制备：将30.000 g(157.89 mmol)川芎嗪(含3分子结晶水)溶于50 mL的苯溶液，加热回流10 h，共沸脱水，得到无水川芎嗪。将10.000 g(73.53 mmol)无水川芎嗪溶于60 mL CCl4中，加入 N-溴代丁二酰亚胺9.170 g(NBS，51.52 mmol)，2者均匀搅拌于白炽灯照射下回流12 h，冷却，减压浓缩，残余物至冰箱中静置，得到溴代川芎嗪，为淡红色半油状物(图1)。

图1 溴代川芎嗪合成路线Fig.1 Synthesis of TMP-BrA：benzene，reflux，10 h，100%;B：CCl4，NBS，hv，reflux，10～12 h，70%;1：ligustrazine·3H2O;2：ligustrazine;3：bromo TMP.

2)齐墩果酸乙酰甲酯的合成：往0.464 g(2.16 mmol)溴代川芎嗪、0.985 g(2.16 mmol)齐墩果酸和25 mL无水丙酮的溶液中加入0.690 g(5 mmol)碳酸钾。反应化合物回流搅拌12 h，采用硅胶薄层监测反应，至原料基本消失后，停止反应，过滤，减压浓缩，加入3.3 g硅胶减压蒸干拌样，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯=5∶1洗脱，丙酮重结晶，得到无色晶体6(图2)。

图2 化合物齐墩果酸乙酰甲酯的合成Fig.2 The synthesis of compound OA-acetonyl derivativeC：acetone，K2CO3，reflux，12 h，31%;4：bromo ligustrazine;5：OA;6：OA-acetonyl derivative;7：3β-Hydroxyolea-12-en-28-oic acid-3，5，6-trimethylpyrazin-2-methyl ester;OA：oleanolic acid.

3)去氧胆酸乙酰甲酯的合成：往0.464 g(2.16 mmol)溴代川芎嗪、0.847g(2.16mmol)去氧胆酸和25 mL无水丙酮的溶液中，加入0.690 g(5 mmol)碳酸钾。反应化合物回流搅拌12 h，采用硅胶薄层监测反应，至原料基本消失后，停止反应，过滤，减压浓缩，加入3.3 g硅胶减压蒸干拌样，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯=5∶1洗脱，得到白色粉末9(图3)。

图3 化合物去氧胆酸乙酰甲酯的合成Fig.3 The synthesis of compound DA-acetonyl derivativeD：acetone，K2CO3，reflux，12 h，27%;4：bromo ligustrazine;8：DA;9：DA-acetonyl derivative;10：3α，12α-Dihydroxy-5β-dholanic acid-3，5，6-trimethylpyrazin-2-methyl ester;DA：deoxycholic acid.

1.5 齐墩果酸乙酰甲酯和去氧胆酸乙酰甲酯对新生血管生成的抑制活性

根据本课题组前期工作基础，将德国罗曼鸡胚蛋置于恒温37℃、恒湿(65%)孵化箱中培养［6-7］。培养到第7天，在无菌的环境下于气室端开启1 cm2小孔，剥离上层气室膜，迅速在CAM上分别植入载药明胶海绵，包括齐墩果酸乙酰甲酯(10 μg/egg、40 μg/egg)、去氧胆酸乙酰甲酯(10 μg/egg、40 μg/egg)和空白组(0.9%氯化钠注射液);之后，用医用胶带封口并继续培养3 d。

实验第11天，揭开封口胶带，以甲醇-丙酮(1∶1)液固定10 min，剥离CAM膜置于载玻片上，解剖显微镜下拍照，通过图像处理软件(Image Professional Plus 5.0)对鸡胚照片进行数据采集，采集直径＜100 μm的新生血管个数。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 齐墩果酸乙酰甲酯和去氧胆酸乙酰甲酯结构分析

1)齐墩果酸乙酰甲酯：TMP和NBS通过自由基反应，制备中间体TMP-Br 7.75 g液体(图1)。通过TMPBr与齐墩果酸在碱性条件下发生亲核取代反应，得到化合物6，无色晶体0.28 g(图2)，产率31.0%，熔点219.7℃～220.6℃。

1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ(ppm)：0.75，0.79，0.92，0.93，0.96，1.01，1.17(s，3H，each，7 ×CH3)，3.234(m，1H，3，β-CH)，5.311(brs，1H，H-12)，4.62，4.56(ea，d，J=16.5 Hz，1H，H-1＇)，2.18(s，3H，H-3＇)，1.00～2.50(24H，三萜母核结构中的亚甲基和次甲基氢信号)。

13C-NMR(125 MHz，CDCl3)：38.5(C-1)，27.2(C-2)，79.0(C-3)，38.8(C-4)，55.2(C-5)，18.4(C-6)，33.1(C-7)，39.3(C-8)，47.6(C-9)，37.1(C-10)，23.6(C-11)，122.6(C-12)，143.6(C-13)，41.8(C-14)，27.7(C-15)，23.2(C-16)，46.8(C-17)，41.3(C-18)，46(C-19)，30.7(C-20)，33.9(C-21)，32.7(C-22)，28.1(C-23)，15.6(C-24)，15.4(C-25)，17.0 (C-26)，25.9(C-27)，177.0(C-28)，32.4(C-29)，23.4(C-30)，68.1(C-1＇)，202.4(C-2＇)，26.4(C-3＇)。IR，cm－1：3559，2940，2863和1724。

2)去氧胆酸乙酰甲酯

通过TMP-Br与去氧胆酸在碱性条件下发生亲核取代反应，得到化合物9白色粉末0.19 g(图3)，产率27.0%，熔点157.8℃～158.8℃。

1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ(ppm)：0.68(s，3H，18-CH3)，0.90(s，3H，19-CH3)，0.98(d，3H，21-CH3)，3.61(m，1H，3β-CH)，3.98(m，1H，12β-CH)，4.64(brs，2H，H-1＇)，2.15(s，3H，H-3＇)，1.00～2.50(28H，甾体母核结构中的亚甲基和次甲基氢信号)。

13C-NMR(125 MHz，CDCl3)：35.0(C-1)，30.5(C-2)，71.8(C-3)，36.5(C-4)，42.1(C-5)，27.2(C-6)，26.1(C-7)，36.1(C-8)，33.7(C-9)，34.1(C-10)，28.7 (C-11)，73.1(C-12)，46.5(C-13)，48.3(C-14)，23.7 (C-15)，27.4(C-16)，47.3(C-17)，12.7(C-18)，23.2 (C-19)，35.2(C-20)，17.3(C-21)，31.6(C-22)，30.9 (C-23)，173.4(C-24)，68.2(C-1＇)，201.7(C-2＇)，26.1 (C-3＇)。IR，cm－1：3531，3492，2934，2862和1734。

图4 CAM模型上化合物齐墩果酸乙酰甲酯和去氧胆酸乙酰甲酯对新生血管作用Fig.4 Microvascular proliferation of oleanolic acid-acetonyl derivative and deoxycholic acid-acetonyl derivative on CAM(50×)A：control for compound oleanolic acid-acetonyl derivative group;B：10 μg/egg for compound oleanolic-acid acetonyl derivative group;C：40 μg/egg for compound oleanolic acid-acetonyl derivative group;D：control for compound deoxycholic acid-acetonyl derivative group;E：10 μg/egg for compound deoxycholic acid-acetonyl derivative group;F：40 μg/egg for compound deoxycholic acid-acetonyl derivative group;OA：oleanolic acid;DA：deoxycholic acid;CAM：chorioallantoic membrane.

2.2 CAM新生血管抑制活性

1)形态学观察：胚蛋经过7 d的孵化，加药3 d之后，在解剖显微镜下观察给药组与空白组的CAM新生血管生长情况，发现空白组新生毛细血管从载体边缘辐射状发出，其数目与给药组相比明显增多，详见图4。

2)抑制新生血管生成活性：去氧胆酸乙酰甲酯对CAM新生血管生成有明显抑制作用，结果详见表1。

表1 化合物齐墩果酸乙酰甲酯和去氧胆酸乙酰甲酯对CAM新生血管生成活性Tab.1 Microvascular proliferation of OA-acetonyl derivative and DA-acetonyl derivative on CAM

3 讨论

Folkman J等［8］早在1971年就提出抑制新生血管生成可以有效的抑制肿瘤的生长和扩散，临床实践证明抗血管生成药与化疗药合用可以大大提高对癌症的治疗效果［9］。CAM模型作为药物体外抗血管生成活性评价的经典模型已被广泛采用［4-5］。本研究应用CAM模型评价，发现化合物去氧胆酸乙酰甲酯对新生血管显示了较强的抑制作用。

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