星点设计-效应面法优化穿心莲总内酯固体脂质纳米粒处方

盛欢欢，邹小广，杨涛，李岩，程雪梅，王峥涛，王长虹*

(1.上海中医药大学中药研究所;中药标准化教育部重点实验室;中药新资源与质量标准综合评价国家中医药管理局重点研究室;上海市复方中药重点实验室，上海201210;2.新疆喀什地区第一人民医院，新疆喀什844000;3.新疆医科大学药学院药剂教研室，新疆乌鲁木齐830054)

星点设计(Central composite design，CCD)是近年来常用的试验设计方法［1-3］，可以解决均匀设计和正交试验设计的不足，既较好地保证了试验精度，又可以分析各因素之间的相互作用，同时试验次数也较少。效应面优化法(Response surface methodology，RSM)是集数学和统计学方法于一体的优化方法，通过描绘效应对考察因素的效应面，依据该模型可以描绘三维效应面图(或称因变量面图)或二维等高线图，从效应面或等高图上选择较佳的效应区，从而回推出自变量取值范围(即最佳实验条件)。

穿心莲总内酯(Total lactones from Andrographis paniculata，TLA)是从爵床科植物穿心莲Andrographis paniculata(burm.f.)Nees中提取的有效成分［4-5］，主要包括穿心莲内酯(Andrographolide，AND)、新穿心莲内酯(Neoandrographolide，NEO)、14-去氧穿心莲内酯(14-Deoxy-andrographolide，DEO)和脱水穿心莲内酯(Dehydroanddrographolide，DEH)等，具有抗菌、消炎、抗肿瘤等多种药理活性［6-7］。为了提高其生物利用度，人们对穿心莲总内酯自微乳、自乳化软胶囊、滴丸、β-环糊精包合物、脂质体等新剂型进行了广泛的研究［8-13］。如穿心莲内酯自微乳使其生物利用度相对于其片剂提高了1.16倍［8］，脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯脂质体使其生物利用度相对于溶液剂提高了1.19倍［13］。但是，微乳、脂质体等制剂具有稳定性差等缺点。固体脂质纳米粒(Solid lipid nanoparticles，SLN)是近年发展的一种新型纳米载药体系，它以天然的或人工合成的固体脂质(如饱和脂肪酸甘油酯、硬脂酸、混合脂质等)为载体，将药物吸附或包裹于脂质核中制成的纳米给药体系［14-17］。具有控制药物释放、提高药物的稳定性和生物利用度、降低药物的毒副作用等优点。因此，本实验旨在采用星点设计-效应面优化法优化穿心莲总内酯固体脂质纳米粒(TLA-SLN)处方，为进一步提高其药物稳定性及生物利用度。

1 仪器与试药

1.1 仪器Waters 高效液相色谱仪(Empower Pro色谱数据工作站，996二极管阵列检测器，600四元泵，717plus自动进样器，在线脱气机，Waters Co.);NS 1001L Panda 2K型高压匀质机(意大利Niro Soavi);EYELA旋转蒸发仪(东京理化公司);SHB-III循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);DK—S24型电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司);5415R离心机(Eppendorf，德国);BP211D Sartorius电子天平(Sartourius Co.GM);ODS分析色谱柱Kromasil-C18柱(5 μm，4.6 mm×150 mm);超纯水器(Millipore公司);Millipore超滤离心管(Microcon YM-10，MWCO为10 kDa，USA)。

1.2 药品与试剂穿心莲内酯对照品(中国药品生物制品检定所，批号:110797-200307);新穿心莲内酯对照品(上海中药标准化研究中心，纯度≥98.5%);14-去氧穿心莲内酯对照品(北京美迪克斯生物技术有限公司，批号:DXP28001);脱水穿心莲内酯对照品(中国药品生物制品检定所，批号:110854-200306);单硬脂酸甘油酯(中国医药集团上海化学试剂公司，批号:F20100210);卵磷脂(上海国药集团化学试剂有限公司，批号:F20100910);山嵛酸甘油酯(Compritol 888 ATO，批号:3123PPD);Tween-80(上海国药集团化学试剂有限公司，批号:F20091214);无水甲醇(上海国药集团化学试剂有限公司，批号:F20100914);无水乙醇(上海国药集团化学试剂有限公司，批号:F20101017);乙腈(色谱纯，Fisher);穿心莲总内酯提取物(含穿心莲总内酯50%，批号:XC090701西安小草植物科技有限公司);穿心莲总内酯固体脂质纳米粒(自制，批号分别为20110105-1，20110105-2，20110105-3)。

2 方法与结果

2.1 穿心莲总内酯固体脂质纳米粒的制备采用冷却高压均质法(Cold-high pressure homogenization technique)制备穿心莲总内酯固体脂质纳米粒。称取处方量的山嵛酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、卵磷脂、穿心莲总内酯，在(80±2)℃水浴下溶于适量无水乙醇中，挥除溶剂，迅速移至冰箱(－20℃)中冷冻2 h。取一定量的Tween-80分散于水中，形成均匀的水相，加入上述制得的固体，用高速分散器10 000 r/min分散为均匀的初乳，室温条件下高压均质机600 bar均质7次，冰浴迅速冷却，即得穿心莲总内酯固体脂质纳米粒。

2.2 包封率的测定参考前期建立的穿心莲总内酯固体脂质纳米粒包封率和载药量测定方法［18］，采用HPLC法测定穿心莲总内酯固体脂质纳米粒的包封率，对处方组成进行优化。

2.3 穿心莲总内酯固体脂质纳米粒的处方筛选在预试验的基础上，选择对穿心莲总内酯固体脂质纳米粒性质影响较显著的3个因素为考察对象，即药脂比%(X1)、磷脂脂质比(X2)、Tween-80在水中的质量分数(X3)。根据预试验结果及在最高或最低水平时制备穿心莲总内酯固体脂质纳米粒的可行性，综合选择各因素的水平(见表1)，以穿心莲内酯的包封率(Y1)、新穿心莲内酯的包封率(Y2)、14-去氧穿心莲内酯的包封率(Y3)和脱水穿心莲内酯的包封率(Y4)的满意度函数为评价指标(表2)，对试验结果进行拟合分析。

当指标较多时，根据每个指标优选的条件可能相互矛盾，对某一效应有利的条件可能对其他效应不利，各效应间需要达成妥协，使所有指标综合为一个值，该值可反映总体效应结果。数据处理办法为满意度函数法［3］，每个指标均标准化为0～1间的满意度函数(desirability function，DF)，各指标满意度函数求算几何平均数，得总评满意度函数。本实验有4个指标，所以DF=(d1d2d3d4)1/4。对取值越小越好的因素和取值越大越好的因素分别进行数学转换求满意度函数dmin和dmax。本实验对4个指标成分的包封率进行归一化处理，包封率要求越大越好，所以使用dmax=(Yi－Ymin)/(Ymax－Ymin)。考虑到4个指标对总评满意度函数的贡献不同，将每一个指标成分的满意度函数乘以权重系数(按照提取物中4个指标成分的量而定，即穿心莲内酯、新穿心莲内酯、14-去氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的权衡系数分别为0.516 0、0.058 8、0.016 2和0.018 2)，得总评满意度函数值见表2。

表1 星点设计因素与水平Tab.1 Factors and levels for central composite design

表2 星点实验设计与结果Tab.2 Arrangement and results of central composite design

2.4 模型拟合应用Design Expert 7.0软件，以DF值为因变量对各因素进行多元线性回归和二项式拟合分析。

多元线性拟合回归方程为:Y=8.962 0×10－3+3.690 8×10－3X1－2.642 4×10－3X2+3.347 7×10－3X3，相关系数(R)为0.624 5，P＜0.05。

多元二项式拟合方程为:Y=－0.033 8+0.023 7X1－0.034 1X2+4.076 7×10－3X3+1.899 0×10－3X1X2－2.116 1×10－3X1X3+0.015 3X2X3－1.147 4×10－3－0.011 2－8.417 0×10－4，相关系数(R)为0.947 8，P＜0.001。

二元非线性方程拟合度较高，最终选择二元非线性方程拟合，并绘制效应面图(图1～图3)。由于三维图只能表示效应对其中二个因素的关系，通常的处理方式是将另一个因素置为中心值，再描绘效应面，结合实验数据DF值(范围0.041～0.053)在图上选取较佳处方范围:X1=8.45%～10%，X2=0.82%～1.25%，X3=3.00%～4.16%。综合评价，得最佳工艺参数为:X1=10%，X2=1.25%，X3=4%。根据包封率的特性，设定各成分包封率的区域:Y1=74%～90%;Y2＞90%;Y3＞90%;Y4＞90%。然后按此要求重叠各指标的二维等高线图，得到能同时满足以上条件的最佳区域见图4。

由图1～图3可看出，三维效应图均为曲面，说明药脂比(X1)、磷脂脂质比(X2)、Tween-80在水中的质量分数(X3)和DF值呈非线性关系。图1表明随着X1的增大，DF先逐渐增加，后降低。图2说明随着X3增大，DF逐渐增大，X1的增大，DF先增大再降低。图3随着X2，X3的增大，DF逐渐增大。X1，X2，X3用量不同对各指标成分包封率的总评满意度函数的影响不同。

由重叠等高线图(图4)可知，白色区域既是各成分包封率的区域重叠部位，也是选择处方的最佳区域。其进一步缩小了处方的优化区域，大大提高了工作效率。

图1 药脂比(X1)和磷脂脂质比(X2)对DF值的三维效应面图(A)和二维等高线图(B)(Tween-80为3%)Fig.1 Predicted response surface scheme(A)and contour map(B)of independent variables of X1and X2as entrapment efficiency(with 3%Tween-80)

图2 药脂比(X1)和Tween-80在水中的质量分数(X3)对DF值的三维效应面图(A)和二维等高线图(B)(磷脂脂质比为1.25∶1)Fig.2 Predicted response surface scheme(A)and contour map(B)of independent variables of X1and X3as entrapment efficiency(with lecithin∶lipid=1.25∶1)

图3 磷脂脂质比(X2)和Tween-80在水中的质量分数(X3)对DF值的三维效应面图(A)和二维等高线图(B)(药脂比为7%)Fig.3 Predicted response surface scheme(A)and contour map(B)of independent variables of X2and X3as entrapment efficiency(with drug∶lipid:7%)

图4 穿心莲总内酯固体脂质纳米粒处方优化的重叠等高线图(X3=4%)Fig.4 The overlapping contour map of the optimal TLA-SLN formulation(X3=4%)

2.5 优化工艺验证照上述优化处方(穿心莲总内酯50 mg;单硬脂酸甘油酯250 mg;山嵛酸甘油酯250 mg;卵磷脂625 mg;4%Tween-80 50 mL)采用冷却-均质法制备3批穿心莲总内酯固体脂质纳米粒，测定包封率总评满意度函数的预测值与实际值的相对偏差见表3。由表3可知，偏差的绝对值均小7%，说明实验所得拟合方程可以很好的预测各因素和评价指标之间的关系。

表3 优化处方评价指标的预测值和实测值(n=3)Tab.3 Comparison of the observed and predicted values of the optimum formulations

按照优化处方3批穿心莲总内酯固体脂质纳米粒，经过分析测定结果表明，穿心莲内酯、新穿心莲内酯、14-去氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的包封率分别为(80.04±0.70)%、(94.94±3.87)%、(92.17±1.61)%、(97.64±0.68)%，载药量分别为(4.11±0.04)%、(0.56±0.02)%、(0.15±0.00)%、(0.18±0.00)%［16］。平均粒径为(322.67±2.50)nm，Zeta电位为(－17.98±1.19)mV。

3 讨论

选择适合于非线性拟合的实验设计方法，可以提高优化效果，减少试验次数，预测性好。星点设计就是一种较为成熟的方法。根据其所建立的数学模型描绘效应面，直接读取较佳工艺条件区域。多个效应所选择的较佳条件通过叠加，可以进一步缩小较佳条件范围［19］。本实验采用星点设计安排实验，数据采用效应面法来进行处理，用多元线性方程和二项式方程来对数据分别进行拟合，从拟合方程的相系数R值可见，4个指标采用二项式方程拟合效果较好。

本实验以穿心莲总内酯中的穿心莲内酯、新穿心莲内酯、14-去氧穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯4种已知可定量的成分为研究对象，以其包封率为指标优化穿心莲总内酯固体脂质纳米粒的处方。若将全部的影响因素看成一个整体(单位1)，4个已知成分(穿心莲内酯、新穿心莲内酯、14-去氧穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯)在穿心莲总内酯中占到总量的61%，而其余的39%为未知成分。在计算满意度函数时，穿心莲内酯、新穿心莲内酯、14-去氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的权衡系数分别取值为0.516 0、0.058 8、0.016 2和0.018 2，其总和为0.61。当将这些可定量测定的指标成分作为一个固定的影响系数的整体来看待时，即相当于提取物中其它未知成分(占39%)的影响系数也随之确定。依此对穿心莲总内酯固体脂质纳米粒的处方进行了优化，为其它多指标成分的中药提取物制剂处方优化提供了一种有效的实验设计方法的参考。

从验证实验结果可以看出，穿心莲总内酯中的4个主要成分穿心莲内酯、新穿心莲内酯、14-去氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的包封率分别为(80.04±0.70)%、(94.94±3.87)%、(92.17±1.61)%、(97.64±0.68)%。从4个成分的结构可以看出，新穿心莲内酯、14-去氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯与穿心莲内酯相比，均是在穿心莲内酯分子结构中的14位去羟基化后得到的一系列衍生物，而使分子极性发生了变化。说明不同成分的理化性质特别是脂溶性与其包封率差异密切相关。

将溶解度低、吸收不良、稳定性欠佳的药物进行纳米化是提高其生物利用度的途径之一。本实验对穿心莲总内酯固体脂质纳米粒的处方进行了研究，但其生物利用度如何，还有待于进一步考察和评价。

［1］Aberturas M R，Molpeceres J，Guzman M，et al.Development of a new cyclosporine formulation based on poly(caprolactone)microspheres［J］.J Microencapsul，2002，19(1):61-72.

［2］刘艳杰，向荣武.星点设计效应面法在药学试验设计中的应用［J］.中国现代应用药学杂志，2002，24(6):455-457.

［3］宗志宇，何桢，孔祥芬.产品设计中多响应优化方法的比较研究［J］.组合机床与自动化加工技术，2005，46(12):1-3.

［4］陈丽霞，曲戈霞，邱峰.穿心莲二萜内酯类化学成分的研究［J］.中国中药杂志，2006，31(19):1594-1597.

［5］肖树雄，王晓钰，郑剑红，等.穿心莲的成分及其分析方法研究概况［J］.中国药师，2002，5(11):396-397.

［6］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:251.

［7］戴桂馥，王俊峰，何帅伟，等.穿心莲内酯及其衍生物的药理活性研究进展［J］.中成药，2006，28(7):1032-1035.

［8］杜红，牛欣，冯前进，等.穿心莲内酯口服微乳与穿心莲内酯片在家兔体内生物利用度的比较研究［J］.中药新药与临床药理，2007，18(3):217-219.

［9］孟慧，许勇.穿心莲内酯自乳化软胶囊的制备和溶出度评价［J］.药学实践杂志，2010，28(3):184-185.

［10］周家才，梁玉梅，周久培.HPLC法测定穿心莲内酯滴丸中穿心莲内酯的含量［J］.安徽医药，2004，8(4):284-285.

［11］王瑜真，张卫星，谭晶，等.β-环糊精包合穿心莲内酯方法比较［J］.实用医药杂志，2004，21(1):45-46.

［12］于波涛，张志荣.穿心莲内酯脂质体的制备及体外释放特性［J］.中国医药工业杂志，2009，40(2):114-116.

［13］王志刚.脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯脂质体的研究［D］.沈阳药科大学，2001.

［14］胡勤，彭芳，玲龙荣.固体脂质纳米粒作为药物载体的研究进展［J］.医学临床研究，2008，25(9):1701-1703.

［15］韩飞，刘洪卓，李三鸣.固体脂质纳米粒和纳米结构脂质载体在经皮给药系统中的研究进展［J］.沈阳药科大学学报，2008，25(10):839-844.

［16］Freitas C，Muller R H.Correlation between long-term stability of solid lipid nanoparticles(SLN)and crystallinity of the lipid phase［J］.Eur J Pharm Biopharm，1999，47(2):125-153.

［17］Gohia S H，Dingler A.Scaling up feasibility of the production of solid lipid nanoparticles(SLN)［J］.Pharmazie，2001，56(1):61-68.

［18］盛欢欢，杨涛，李岩，等.HPLC法测定穿心莲总内酯固体脂质纳米粒载药量与包封率［J］.中成药，2012，34(3):459-463.

［19］Siracha T，Ampol M，Teerakiat K，et al.Development and optimization of micro/nanoporous osmotic pump tablets［J］.AAPS Pharm Sci Tech，2010，11(2):924-935.